一株类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的全基因组序列分析

李天宇，常亚飞，阮坤祥，王同燕，谭菲菲，李向东，田克恭

（1.河南农业大学牧医工程学院，郑州 410005；2.国家兽用药品工程技术研究中心，洛阳 471003；3.普莱柯生物工程股份有限公司，洛阳 471000）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以母猪严重流产和各年龄段猪呼吸障碍为特征的重要的病毒性传染病。PRRS在世界范围内广泛流行，给养猪业造成了巨大的经济损失[1]。

PRRSV是一种单股正链、不分节段的RNA病毒，有囊膜，其基因组包括至少10个开放阅读框（open reading frame，ORF）：ORF1a、ORF1ab、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7，其中ORF1a和ORF1ab编码病毒为非结构蛋白，其它ORF编码病毒为结构蛋白[2]。PRRSV主要分为两个基因型：以Lelystad virus（LV）为代表的基因1型（欧洲型）和以VR2332为代表的基因2型（美洲型）[3]。1996年，我国首次分离到PRRSV，并将其命名为CH-1a毒株[4]；2006年，高致病性PRRS（highly pathogenic PRRS，HPPRRS）在我国流行其病原体被命名为高致性PRRSV（highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV）[5]；2013年，周峰等[6]首次分离到一株类PRRSV毒株，该毒株在NSP2基因区存在131（111+1+19）个氨基酸的不连续缺失。以HENAN-XINX和HENAN-HEB为代表，与2008年美国分离到的NADC30毒株类似，因此将该类毒株命名为类NADC30。之后，类NADC30型PRRSV逐步在我国流行[7-8]。

本研究从临床样品分离获得一株类NADC30 PRRSV，命名为180404-2fei，对其NSP2基因、ORF5基因以及全基因组序列进行同源性分析和遗传进化分析，并对全基因进行了重组分析。

1 材料与方法

1.1 病料及处理 采集某猪场疑似患有PRRS发病猪的肺脏，剪碎、研磨，提取病毒基因组。

1.2 主要试剂 反转录酶（M-MLV）、RNA酶抑制剂、dNTP购自Promega公司；高保真的DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；2×TaqPCR MasterMix购自天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白胨、酵母浸出液购自OXOID公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要设备 Mini台式离心机购自德国Eppendorf公司；PCR仪购自ABI公司；紫外透射分析仪购自其林贝尔公司；琼脂糖凝胶电泳仪购自美国Hoefer公司；紫外成像仪购自美国UVP公司；恒温培养箱购自德国MMM公司；空气浴震荡摇床购自美国NBS公司。

1.4 引物设计 根据PRRSV美洲型毒株VR-2332（GenBank登录号：U87392）和NADC30（GenBank登录号：JN654459）全基因组序列，应用Primer Premier 5.0软件设计12对引物，所有引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

1.5 样品的全基因获取 将研磨液在4℃ 10 800×g条件下离心10 min，取上清，按照核酸提取试剂盒Viral Nucleic Acid Extraction Kit的操作说明提取核酸，按照M-MLV Reverse Transciptase的操作说明反转录为cDNA。使用PRRSV鉴定和分型引物，按照2×TaqPCR MasterMix说明对上述cDNA进行鉴定和分型。使用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase对类NADC30 PRRSV分12段进行扩增。PCR反应体系（50 μL）：PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP Mix 4 μL，10 pmol/L上、下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 31.5 μL；反应条件：94℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 kb/min，共33个循环；72℃再延伸7 min。回收目的片段，克隆至pEASY-Blunt载体，阳性克隆送金唯智生物科技公司测序。利用DNAStar对测序的各片段序列进行拼接，最终获得全基因序列。

表1 扩增全基因组序列引物Table 1 Primers used for amplification of full genome

1.6 同源性和遗传进化分析 利用DNAStar软件中的MegAlign对180404-2fei与参考毒株（表2）的NSP2基因和ORF5基因进行序列比对和同源性分析。使用MEGA6.0软件中的邻接法（neighborjoining；bootstrap values of 1000 replicates；Kimura two-parameter）对180404-2fei与参考毒株（表2）的NSP2基因、ORF5基因及全基因进行遗传进化分析。

1.7 重组分析 利用SimPlot软件将180404-2fei与各种类型毒株的代表VR2332、09HEN1和NADC30进行重组分析，绘制重组分析图。

2 结果

2.1 样品的全基因获取结果 利用DNAStar软件对获得的NSP2氨基酸全序列进行比对。结果显示，180404-2fei毒株的NSP2基因在322～432位（图1A）、483位（图1B）及504～522位（图1C）共缺失131（111+1+19）个氨基酸，与2008年美国分离到的NADC30毒株和我国分离到的类NADC30毒株具有相似的缺失特征（图1）。以上结果表明，此毒株属于类NADC30 PRRSV。

2.2 NSP2基因同源性分析结果 利用DNAStar软件中MegAlign将180404-2fei毒株的NSP2基因核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与参考序列（表2）比对。结果显示：180404-2fei毒株的NSP2基因与欧洲型代表株LV毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为53.6%和34.9%；与HP-PRRSV代表株JXA1毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为74.7%和68.9%；与经典型代表株PRRSV VR2332和CH-1a毒株的核苷酸序列同源性分别为77.3%和75.1%，氨基酸序列同源性分别为72.5%和70.4%；与NADC30毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.2%和90.1%。180404-2fei NSP2基因的核苷酸和氨基酸序列与NADC30同源性最高。

表2 参考毒株信息Table 2 The information of reference strains

2.3 NSP2基因遗传进化分析 目前PRRSV分为欧洲型和美洲型，其中美洲型又分为5个亚群，即以NADC30为代表的NADC30-Like亚群、以VR2332为代表的VR2332-Like亚群、以CH-1a为代表的CH-1a-Like亚群、以QYYZ为代表的QYYZ-Like亚群及以JXA1为代表的HP-PRRSV-Like亚群。将180404-2fei毒株与参考毒株（表2）的NSP2基因序列进行比对，利用MEGA6.0软件构建进化树（图2），NSP2基因的遗传演化分析结果表明，180404-2fei毒株属于NADC30-Like亚群。

2.4 ORF5的同源性分析 利用DNAStar软件中MegAlign将180404-2fei毒株的ORF5基因核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与参考序列（表2）比对。结果显示，其与欧洲型LV毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为62.1%和53.2%；与VR2332和CH-1a的核苷酸序列同源性分别为85.1%和85.7%，氨基酸序列同源性分别为82.1%和84.6%；与JXA1的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.1%和83.6%；与NADC30的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为93.5%和92.0%。180404-2fei ORF5基因的核苷酸和氨基酸序列与NADC30同源性最高。

2.5 ORF5基因序列的遗传进化分析 将180404-2fei毒株与参考毒株（表2）的ORF5基因序列比对，利用MEGA6.0软件构建进化树。ORF5基因的遗传演化分析结果表明，180404-2fei毒株属于NADC30-Like亚群（图3）。

2.6 全基因遗传演化分析 将180404-2fei毒株与参考毒株（表2）的全基因序列进行比对，利用MEGA6.0软件构建进化树。结果显示，180404-2fei毒株与以VR2332和CH-1a为代表的经典型毒株和以JXA1为代表的HP-PRRSV毒株同属于美洲型（2型），但属于不同的亚群；其与NADC30、HNyc15、HENANXINX同属于一个亚群。全基因的遗传演化分析结果表明，180404-2fei毒株属于NADC30-Like亚群（图4）。

2.7 重组分析 利用SimPlot软件将180404-2fei与参考毒株VR2332、09HEN1和NADC30进行重组分析。结果显示，180404-2fei与HP-PRRSV存在重组，重组区域为5439～8035（图5）。表明180404-2fei毒株是一个以NADC30毒株为母本，同时由HP-PRRSV毒株提供重组片段的重组病毒。

图1 NSP2基因的氨基酸序列比对分析Fig.1 Comparison of amino acid sequences of NSP2 gene

图2 基于NSP2基因核苷酸序列的遗传进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of NSP2 gene

图 3 基于 ORF5 基因核苷酸序列的遗传进化分析Fig .3 Phylogenetic analysis based on nucleotide sequences of ORF5 gene

图5 PRRSV 180404-2fei毒株的重组分析Fig. 5 Recombination analysis of PRRSV strain 180404-2fei

3 讨论

PRRS是世界养猪业中的重大传染病之一。1996年，我国首次报道分离到PRRSV。2006年，我国南方广泛流行HP-PRRS，给我国养猪业造成了巨大经济损失。2008年，美国学者分离到一株PRRSV，并将其命名为NADC30，其特征是在NSP2区存在131个氨基酸的不连续缺失。2013年，周峰等[6]在我国分离到在NSP2区与NADC30毒株具有相同缺失特征的毒株，称之为类NADC30。随后，类NADC30 PRRS在全国各地广泛流行。近几年，本实验室针对类NADC30毒株进行了持续跟踪研究[9-13]。

了解病毒基因组结构的重要途径是全基因序列测定与分析。PRRSV基因组中编码非结构蛋白的NSP2基因变异最大，主要表现在碱基的缺失、置换和插入上，可以作为检测PRRSV变异的标记基因。通过对180404-2fei毒株的NSP2基因核苷酸及推导的氨基酸序列与参考序列进行比对分析、遗传进化分析，证实了该毒株在NSP2区有不连续的131（111+1+19）个氨基酸缺失，属于类NADC30 PRRSV。

PRRSV基因组中编码结构蛋白的ORF5基因变异很大，ORF5基因编码的GP5蛋白为PRRSV的免疫原性蛋白，可诱导产生中和抗体，在引起特异性细胞免疫方面起着重要作用。研究发现ORF5基因是分析PRRSV多样性的靶基因。通过对180404-2fei毒株的ORF5基因序列分析发现，该序列与NADC30毒株遗传距离较近，同处一个亚群，而与VR2332毒株遗传距离较远。

PRRSV是单股正链RNA病毒，为适应环境，易发生重组。大量研究表明，类NADC30 PRRSV容易发生重组，如类JL580和FJ1402毒株是由NADC30 PRRSV和HP-PRRSV重组而成[7,14]。本研究对180404-2fei毒株进行重组分析发现180404-2fei与HP-PRRSV存在重组，进一步证实了类NADC30 PRRSV的重组现象。

本研究基于获得的180404-2fei全基因序列，对NSP2基因和ORF5基因的核苷酸和氨基酸序列进行同源性分析，对该毒株NSP2基因、ORF5基因进行遗传演化分析，并对该毒株进行全基因重组分析，最终确定180404-2fei属于类NADC30 PRRSV，并与HP-PRRSV存在重组。本研究丰富了类NADC30毒株的基因组信息，同时为该类毒株的防控提供了数据支持。