2017～2018年华中地区猪圆环病毒2型分子流行病学分析

邓文芳，宋文博，胡星星，贾 双，陈翔鸿，喻红艳，汤细彪

（武汉科前生物股份有限公司，武汉 430070）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），其核酸是一种单股、闭合、环状DNA分子，基因组大小约为1766 bp[1]。PCV2自1998年首次被发现后就一直受到世界的关注，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（posting-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原之一，可在淋巴系统内增殖引起机体免疫抑制，导致免疫力下降，并引起其他病原的继发感染[2-3]。此外PCV2常与猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory sydrome，PRRSV）、猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）混合感染。

PCV2的ORF2基因主要编码衣壳蛋白（Cap蛋白），为PCV2主要免疫原性蛋白。根据PCV2 ORF2基因序列的差异，PCV2可以分为2a、2b、2c、2d、2e等基因亚型。前期研究表明，PCV2b为我国流行的主要基因亚型，具有致病性；国外学者通过基因序列分析发现PCV2流行的主要基因亚型有从PCV2b向PCV2d转变的趋势[4-7]。2016年，Xiao等[8]报道，美国PCV2d感染率从2012年37.8%上升到2017年72.0%，说明PCV2d已替代PCV2b成为主要的流行毒株。本实验采集华中地区3个省份疑似PCV2感染的样品进行检测，对其中38份阳性样品进行ORF2基因克隆和测序，并进行同源性分析和遗传进化分析，初步掌握了2017～2018年我国PCV2的分子流行趋势，为PCV2的临床防控提供了依据。

1 材料与方法

1.1 样品 2017～2018年间共采集华中地区（湖北、湖南、河南）1592份疑似PCV2感染的组织样品，包括肺脏、肾脏、淋巴结和脾脏等，放入-80℃冰箱备用。

1.2 主要试剂 病毒核酸提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司，pMD19-T载体和DL1000 DNA marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 病毒DNA的提取 将组织样品剪碎后，加入500 μL PBS稀释，经全自动组织研磨机混合研磨制成匀浆，-80℃反复冻融3次，6000×g离心10 min，取上清液。按照病毒核酸提取试剂盒说明书操作步骤提取病毒DNA，并置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 引物的设计与合成 根据GenBank中登录的PCV2序列（GenBank登录号：AY424401.1）设计引物，见表1。F1/B1为样品PCV2检测引物，目的片段为496 bp；F2/B2为ORF2基因序列克隆引物，目的片段为958 bp，引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 本研究引物Table1 Primers used in this study

1.5 样品的PCR检测 以提取的病毒DNA为模板，以F1/B1为引物进行PCR扩增。反应体系（20 μL）：2×EasyTaqPCR SuperMix 10 μL，F1、B1各1 μL，ddH2O 6 μL，DNA模板2 μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸10 min。取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察检测结果。

1.6 ORF2基因的克隆及测序 在鉴定为PCV2阳性的部分样品中，按月份随机选取条带较亮样品的病毒DNA，用基因克隆引物F2/B2进行ORF2基因序列扩增，反应体系（20 μL）：2×EasyTaqPCR SuperMix 10 μL，F2、B2各1 μL，ddH2O 5 μL，DNA模板3μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃退火40 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸10 min。取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察检测结果。将胶回收产物与pMD19-T载体连接后转化，选取单个菌落，接种于含100 mg/L Amp的LB液体培养基中，37℃、300r/min振荡培养12 h，使用F2/B2引物进行菌液PCR鉴定。对鉴定为阳性的菌液进行质粒提取，送至生工生物工程（上海）有限公司测序。

1.7 序列的比对与分析 用DNAStar软件将测序得到的ORF2基因序列与GenBank中已公布的22条参考序列（表2）进行同源性分析和氨基酸多序列比对，采用MEGA 6软件绘制分子遗传进化树。

表2 本实验使用的22株PCV2参考序列Table2 The PCV2 reference sequences used in this study

2 结果

2.1 样品的PCR检测结果 运用PCV2检测引物F1/B1对样品进行PCR扩增，阳性样品能够扩增出大小为496 bp的特异性条带（图1）。样品PCR检测的结果显示：在2017～2018年采集的1592份病料中，1091份样品为PCV2阳性，阳性率为68.53%，湖北、河南和湖南3个省份猪群PCV2感染阳性率分别为68.90%、67.20%、70.70%，表明PCV2在华中地区猪群中感染较为普遍，见表3。

表3 华中地区三省份猪群PCV2感染情况Table 3 PCV2 infection in three provinces of central China

2.2 PCV2 ORF2基因的克隆 在PCV2鉴定阳性样品中按月份随机选取PCR鉴定条带较亮的38份样品（表4）进行PCV2 ORF2基因序列的克隆。利用引物F2/B2进行PCR扩增，可获得大小约为958 bp的目的条带（图2），与预期结果相符。

图1 部分阳性样品PCR鉴定结果Fig.1 Some positive samples were identified by PCR

2.3 PCV2 ORF2基因同源性分析 将阳性PCR产物连接至pMD19-T载体后进行测序，测序结果与22株参考序列进行同源性比对。结果显示：本研究获得的38株PCV2 ORF2序列之间的同源性为89.5%～100%，与22株参考序列的同源性为81.1%～99.9%，其中大部分序列与PCV2d亚型的参考序列KJ680369同源性最高，可达99.9%，部分毒株同源性对比结果见图3。

表4 38株PCV2序列的来源和命名Table 4 Source and name of 38 PCV2 strains

图2 部分阳性样品ORF2基因序列的PCR检测结果Fig.2 PCR results of partial ORF2 gene sequences

2.4 ORF2基因遗传进化分析 将38株PCV2 ORF2基因序列与22株参考序列进行遗传进化分析。结果显示，所获得的38株序列分布于PCV2a、PCV2b、PCV2d 3个分支，其中33株（湖北16株、河南12株、湖南5株）属于PCV2d基因型，占分离株的86.2%；4株（湖北2株、河南1株、湖南1株）属于PCV2b基因型；1株（湖北1株）属于PCV2a基因型，未发现2c和2e基因型，证明2017～2018年华中地区PCV2流行毒株以PCV2d基因型为主（图4）。

2.5 ORF2基因推导氨基酸序列分析 将38株ORF2基因推导的氨基酸序列进行多序列比对和同源性分析，各氨基酸序列之间同源性为89.4%～100%，与22株参考氨基酸序列同源性为94.4%～100%。以AF055394为参考序列对38株ORF2基因推导氨基酸序列进行多序列比对，从图5中可以看出，主要变异位点为53～91、121～151、190～210 aa。另外也存在一些散在的突变位点，如8、30、170、185、205 aa等。I53、K59、R63、N68、T90、L89、T121、N134、R/G169、D210、I215均为PCV2d区别于PCV2b的氨基酸变异位点。另外，如图5中方框位置为文献报道的Cap蛋白表位[9]，其中部分毒株的氨基酸序列发生了变异，这可能和不同毒株之间的毒力差异相关。

图3 部分毒株ORF2基因同源性对比Fig.3 Homology analysis of ORF2 gene of partial strains

图4 PCV2 ORF2基因遗传进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of PCV2 ORF2 gene

3 讨论

近年来，我国动物病原流行病学监测结果显示，PCV2的感染率有明显的上升趋势[10-11]，给养猪业造成了严重的经济损失，如何做好PCV2的防控工作成为当前的一大难题。本研究显示2017～2018年华中地区PCV2的阳性率为68.53%（1091/1592），与2010～2013年四川省PCV2的阳性率（70.7%）接近[3]，然而相较于2008～2011年全国12个省市PCV2的阳性率（78.3%）较低[10]，可能是由于本文的样品检测数目（1592份）远高于前者（452份），且不同地区PCV2感染率有差异。

根据PCV2近年来的分子流行病学调查研究发现，PCV2d基因型已成为我国流行的优势基因型。徐朋丽等[12]在河南省分离出的21株PCV2中，16株属于PCV2d，5株属于PCV2b基因型。本研究中38株PCV2 ORF2基因序列同源性为89.5%～100%，说明华中地区流行的PCV2分子间有差异。同时将38株PCV2 ORF2基因序列与22株参考毒株基因序列进行遗传进化树分析，进化树显示38株序列分属于PCV2a、PCV2b、PCV2d 3个分支，其中PCV2d基因型有33株，说明华中地区以PCV2d为流行基因型。

图5 PCV2 ORF2推导氨基酸序列比对Fig.5 Multiple sequence alignment of amino acid of Cap protein

PCV2的ORF2基因主要编码Cap蛋白，本研究通过比对38株ORF2基因序列推导的氨基酸序列和PCV2b Cap蛋白氨基酸参考序列（GenBank登录号：AAC35331.1）可知，Cap蛋白氨基酸序列在多个区域存在较高的变异，主要变异位点为53～91、121～151、190～210 aa，与国内外多名学者研究结果一致[13-14]。另外，Cap蛋白表面存在的潜在表位在免疫压力下易发生突变，从而改变病毒的毒力和致病性[9]，本研究中在这些蛋白表位区域，不同的毒株序列存在突变，这可能会导致不同毒株之间的差异，给临床PCV2的防控带来一定的难度。目前接种疫苗是PCV2感染的主要防控手段，市场上商品化疫苗以PCV2a和PCV2b基因型为主，但PCV2a和PCV2b基因型疫苗对PCV2d基因型的免疫效果还需进一步研究分析[15]。

本研究初步掌握了2017～2018年华中地区PCV2的流行动态，并对ORF2基因特征进行了初步分析，为临床PCV2的防控提供了一定的指导，也为PCV2d疫苗的研发奠定了基础。