非洲猪瘟病毒多基因家族成员MGF360-12L RPA检测方法的建立

吴映彤，王西西，吴 竞,2，陈鸿军，朱鸿飞，郭晓宇

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.比利时列日大学 让布鲁农学院，列日 4000；3.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

非洲猪瘟（africa swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（Africa swine fever virus，ASFV）引起的家猪和野猪的一种急性、热性和高传染性疾病，其临床症状表现为发热、呕吐、皮肤发绀、内脏器官明显出血等[1]。20世纪初，ASF病例首次发现于肯尼亚，自此ASV疫情迅速在非洲大部分地区蔓延[2]。2007年，ASF疫情在高加索地区的格鲁吉亚出现，随后迅速蔓延至俄罗斯联邦以及东欧等周边国家[3-4]。2018年8月1日，我国辽宁省沈阳市沈北区发现ASF疫情，经B646L/p72基因进化树分析发现该病毒属于基因Ⅱ型，与目前在俄罗斯和东欧流行的Georgia 2007/1毒株属于一个进化分支[5]。目前已在辽宁、河南、江苏、浙江、安徽、黑龙江、内蒙、吉林、天津等9个省直辖市发现ASF疫情。

ASFV基因组大小约为170～190 kb，含有151～167个开放阅读框（open reading frame，ORF），其中约30%的ORF存在多个拷贝，即多基因家族，包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360和MGF505/530，不同分离毒株的ORF拷贝数也各不相同[6]，MGFs家族基因编码的多个拷贝可能为病毒提供了选择进化的优势[7]。由于ASFV中某些基因可干扰宿主免疫应答，缺失这些基因将有助于增强宿主的免疫应答[8]。已有研究发现，ASFV弱毒株OURT88/3在缺失MGF360-10L、11L、12L、13L、14L后，可分别在体内和体外诱导产生较高水平的IFN，并在免疫后提供针对同源基因Ⅰ型及其他基因型的攻毒保护[9-10]。MGFs家族基因缺失疫苗被认为是非洲猪瘟疫苗研制的主要方向之一，因此建立针对MGFs家族基因的鉴别诊断方法尤为重要。当前常用的分子诊断方法主要有PCR、实时荧光定量PCR、环介导技术等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等，但这些方法大多需要昂贵的仪器设备、繁琐的实验程序、较长的检测时间[11-12]或出现检测结果不准确（LAMP）等现象[13]，难以满足检测需要。重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一种新兴的核酸等温扩增技术，该技术对硬件设备的要求很低，在重组酶、单链结合蛋白（single strand DNA-binding protein，SSB）、DNA聚合酶等参与下，以恒定温度即可获得高灵敏性及特异性的核酸扩增产物[14]，可用于体外诊断，适用于兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

鉴于此，本实验比较近年来周边国家报道的ASFV毒株序列，主要根据Georgia 2007/1毒株MGF360-12L基因的参考序列，进行RPA引物设计，筛选最适引物，对反应条件进行优化，并验证检测方法的特异性、灵敏性，为后续ASFV MGF360-12L缺失毒株的鉴别诊断提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 TwistAmpTMDNA amplification kit购自英国TwistDx公司；DNA纯化回收试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒（OMEGA）购自北京佳诚实创科技有限公司；质粒DNA中提试剂盒（GeneMark）购自北京达科为生物技术公司；病毒RNA提取试剂盒、2× Primer STAR Mix、5×Prime Script Mix反转录试剂盒购自北京宝日医生物技术有限公司；2×Reatime PCR Mix（SYBR green）购自北京聚合美生物技术公司；2×TaqPCR Mix购自南京诺唯赞生物技术公司；引物合成与测序送至金唯智生物技术（苏州）公司。

1.2 病毒株和临床样品 含有ASFV Georgia 2007/1毒株12L基因的真核重组质粒pcDNA3.1-12L由本实验室构建并保存。猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）基因组RNA和伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV-2）基因组DNA由本实验室保存；猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）基因组RNA提取自瑞普商品化兔脾淋活疫苗；O型口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）基因组RNA提取自中农威特猪口蹄疫灭活疫苗。15份未知病原的临床样品由本实验室保存。

1.3 标准质粒的构建及拷贝数确定 根据GenBank中ASFV Georgia 2007/1株（GenBank登录号：FR682468.1）参考序列，确定MGF360-12L基因序列信息，合成并克隆至pUC57载体。将目的基因连接至真核载体pcDNA3.1，构建标准重组质粒pcDNA3.1-12L。拷贝数（copies/μL）=6.02×1023×[质粒浓度（ng/μL）×10-9/（质粒碱基数×660）]。

1.4 病毒RNA的提取 根据病毒RNA提取试剂盒提取病毒核酸。按照反转录说明书，将PRRSV、CSFV、FMDV和PEDV基因组RNA反转录为cDNA，并测定其浓度；所有病毒DNA和cDNA模板保存于-20℃备用。

1.5 RPA引物设计 参考GenBank中ASFV Georgia2007/1株MGF360-12L基因序列，设计RPA引物，目的片段大小为216 bp。同时设计普通PCR和实时荧光定量PCR引物，具体见表1。

表1 本研究引物Table 1 The primers used in this study

1.6 RPA检测方法的建立与条件优化 使用TwistAmpTMDNA amplification kit配制50 μL RPA反应体系，其中上、下游引物12L-RPA-F/12L-RPA-R（10 μmol/L）各2.4 μL，rehydration buffer 29.5 μL，DNase/RNase Free H2O 11.2 μL，模板2 μL。将以上试剂预混后转入含冻干酶制剂的反应管中，将2.5 μL 280 mmol/L MgAc加于反应管盖上，盖紧后瞬时离心混匀，分别于38℃反应5、10、20、30 min，RPA产物经回收纯化后，取5 μL进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，确定最适反应引物组合。为筛选RPA最佳反应温度和时间，以标准质粒pcDNA3.1-12L为模板，分别在30℃、35℃、37℃、39℃、40℃、42℃条件下扩增30 min。再将标准质粒置于最适温度，反应5、10、15、20、25、30、35、40 min，以确定最佳反应时间。

1.7 特异性和敏感性试验 分别以PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV的cDNA，PRV、PCV-2的DNA，以及pcDNA 3.1-12L为模板，进行RPA反应，确定该方法特异性。此外，将标准质粒进行10倍倍比稀释，使其浓度为100～106copies/μL，以此为模板进行RPA反应，确定方法的最低检测限。

1.8 普通PCR和实时荧光定量PCR扩增 普通PCR扩增体系（20 μL）：2×TaqMix 10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O补齐。PCR反应程序为：98℃预变性10 min；98℃变性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸90 s，共35个循环；72℃延伸10 min。实时荧光定量PCR 扩增体系（20 μL）：2×Realtime PCR Mix （SYBRgreen）10 μL，上下游引物各0.8 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O补齐。实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性1 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40个循环。将pcDNA3.1-12L标准质粒10倍比稀释（100～106copies/μL）进行普通PCR及实时荧光定量PCR，比较3种检测方法的敏感性。

1.9 临床样品的检测 对实验室保存的15份未知病原的病死猪样品进行处理，提取其RNA、反转录为cDNA，采用RPA和实时荧光定量PCR同时检测，比较两种检测方法的结果是否一致。

2 结果

2.1 标准质粒鉴定及拷贝数的计算 对标准质粒进行双酶切鉴定，结果见图1，大小与预期相符（12L为1053 bp，pcDNA3.1为5428 bp）。鉴定正确的阳性质粒浓度为682 ng/μL，重组质粒碱基数为6423 bp，经计算得知质粒的拷贝数为9.68×1010copies /μL。

2.2 RPA反应引物筛选 以106copies/μL的pcDNA3.1-12L质粒为模板，使用4组引物，进行RPA引物筛选（图2）。结果显示，阳性对照扩增成功；在实验组中，虽然引物组合1首先出现扩增条带，但扩增30 min时出现非特异性条带，而引物组合4扩增目的条带较为单一、亮度较强，因此选取引物组合4用于后续实验。

2.3 RPA反应条件的优化 为筛选反应最佳温度，以106copies/μL的pcDNA3.1-12L为模板，使用上述最适引物进行RPA扩增，在30℃～42℃下最长反应30min。经半定量分析发现，12L基因在35℃时扩增条带较强（图3）。为筛选反应最适时间，将106copies/μL的模板在35℃下扩增5～40 min后发现，反应30 min的样品出现较为稳定的阳性条带（图4），因此选取30 min为最适反应时间。

图1 真核重组质粒酶切结果Fig.1 Enzyme digestion identification results of recombinant eukaryotic vector

图2 12L-RPA扩增引物筛选Fig.2 The selection of 12L-RPA primers

图3 12L-RPA反应温度优化Fig.3 12L-RPA reaction temperature optimization

图4 12L-RPA反应时间优化Fig.4 12L-RPA reaction time optimization

2.4 特异性和灵敏性实验 以pcDNA3.1-12L质粒以及PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV的cDNA，PRV、PCV-2的DNA为模板，扩增后发现只有12L基因出现扩增条带，说明该方法具有良好的特异性（图5）。为确定RPA方法的最小检出量，以100～106copies/μL的pcDNA3.1-12L为模板，扩增后发现，RPA最低可以检测到1×103copies质粒（图6A），与普通PCR（图6B）检测限相同，与荧光定量PCR检测限相近（图6C）。

图5 12L-RPA特异性检测Fig.5 12L-RPA specificity test

2.5 RPA检测方法的应用 通过本研究建立的RPA方法，对15份样品进行检测，结果显示所有样品均为ASFV阴性，与实时荧光检测结果一致。

图6 敏感性检测Fig.6 Sensitivity test results

3 讨论

由于发病病程短、致死率高等特点，ASF已成为危害养猪业的重要疫病之一。该病毒免疫逃逸机制复杂、基因型较多（24个基因型）[15]，目前并未研制出有效的疫苗。研究发现，删除毒株Benin 97/1 MGF360-10L、11L、12L、13L、14L和MGF505-1R、2R、3R及部分基因（MGF360-9L和MGF530/505-4R）后，缺失毒株和亲本病毒在猪巨噬细胞体外的生长特性基本相似；此外，动物免疫攻毒保护实验结果也表明，缺失毒株可以保护实验猪只免受强毒株Benin97/1的攻击[16]。随着缺失疫苗毒株的广泛研究，对此建立快速准确的检测方法同样重要。

对比当前常见的检测方法，RPA主要优势如下：第一，RPA反应中关键酶以冻干颗粒形式存在，易于保存；第二，RPA反应时间一般不超过30 min；第三，RPA属于等温扩增技术，不需要复杂的变温过程，对仪器设备要求较低[17]。目前RPA方法已经广泛应用于多种病原微生物的检测，如PCV-2[18]、猪细小病毒[19]、FMDV[20]、致病性钩端螺旋体[21]、B组链球菌[22]、疟原虫[23-24]等病原检测。此外，在食品安全、生物安全和癌症等领域RPA技术都也已有相关研究。

本研究根据实验构建了pcDNA3.1-12L真核重组质粒，并以此作为标准质粒进行RPA扩增。在引物设计方面，12L-RPA引物长度约为30～35 bp，因为这将有利于单链结合蛋白与寡核苷酸（引物）的结合，使其有效的整合到双链DNA[25]。筛选得到最适引物后，对RPA反应组分引物浓度与模板量进行优化，发现当模板拷贝数较低时，加入引物量越小、模板量越大时，扩增效果较为明显。优化温度区间为30℃～42℃，由图3可知，12L基因在35℃、37℃扩增效果较好，经半定量分析发现，35℃产物量与37℃时的产物量虽相差无几，但35℃下反应重复性、灵敏性较37℃效果更好。建立的RPA检测方法特异性针对ASFV Georgia 2007/1毒株12L基因缺失毒株进行检测，检测限为1×103copies/μL，但反应时间仅为普通PCR的1/4，可初步应用于ASFV Georgia 2007/1 MGF360-12L缺失毒株的鉴别诊断。