贵州省某猪场体表脓肿病原菌的分离鉴定及药敏分析

张天天，王壬琦，陈路铭，罗 芹，蒲翠敏，刘丽娟，李 晨，王开功

（贵州大学动物科学学院，贵阳 550025）

猪脓肿是指组织或器官内形成的外有包膜内有脓汁蓄积的局限性感染病灶，是由于皮肤或黏膜损伤，没有及时处理，使细菌直接侵入并大量繁殖，引起局限性化脓性炎症而发生的脓肿[1]。猪的脓肿病多发于3～10月，尤其以5～8月最为流行[2]。引起脓肿的病原菌有多种，如葡萄球菌（Staphylococcus）、链球菌（Streptococcus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、化脓隐秘杆菌（Pseudomonas pyogenes）等[3-4]。猪患脓肿病后会出现食欲减退、体温升高、精神不振等临床症状，同时脓肿多长于猪的四肢、臀部及颈部，严重妨碍猪的采食、行动及休息，从而影响猪的生长发育、饲料转化率和猪肉的品质。病猪病程过长或脓汁被仔猪误食，会导致猪的死亡，增大经济损失。为提升规模化猪场的经济效益，应及时对猪场脓肿病进行预防及治疗。

本研究通过对贵阳市某规模化养猪场实地考察，初步了解猪脓肿病的发病季节、年龄、种群、感染部位等并记录；同时，采集发病部位的脓汁，进行细菌分离鉴定，对分离到的细菌性病原体进行药敏试验；根据研究结果总结该猪场猪脓肿引发原因、发病情况、主要致病菌及其敏感药物，为该猪场猪体表脓肿的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验样本 2018年7月无菌采集贵阳市高坡乡某规模化养猪场患病猪体表未破裂脓包中脓汁6份，分别编号为1～6号样本，低温运输。

1.2 试剂与培养基 革兰氏染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；叠氮钠葡萄糖肉汤购自青岛海博生物技术有限公司；普通培养基、血琼脂培养基细菌微量生化反应管、药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 实验动物 30 g雌性健康小鼠24只，购自贵州医科大学试验动物中心。

1.4 细菌的分离培养 将无菌采集的1～6号脓汁样本采用划线法接种于血琼脂培养基中，每份样品接种两组平板；一组有氧培养，一组无氧培养，置37℃恒温箱培养12～48 h，观察细菌的生长情况。挑取形态不同菌落接种于培养基进行纯培养。

1.5 革兰氏染色镜检 取50 μL纯培养菌液滴加在载玻片上抹匀，烘干（火焰固定）后革兰氏染色镜检。

1.6 细菌的生化特性鉴定 将纯化培养的菌液，接种于生化鉴定管中，置恒温箱37℃培养12～48 h，观察结果并按照细菌生化鉴定手册及参考相关文献[7-10]进行初步鉴定。

1.7 药敏试验 选用临床上较为常用的13种抗菌药物，运用纸片扩散法将药敏纸片分别置于涂有目的菌的培养基上，置于37℃恒温培养箱培养12～48 h；测量抑菌圈直径并与杭州微生物试剂公司《药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准》比较，根据抑菌圈的大小将细菌分为敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。

1.8 16S rDNA的PCR扩增与测序 细菌16S rDNA引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成，上游：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGAT GA-3'，下游：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT AGC-3'。以分离到的3株细菌DNA为模板，利用细菌的16S rDNA基因的通用引物进行PCR扩增。

反应总体系（50 μL）：GreenTaqMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板4 μL，ddH2O 17 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸110 s，共30个循环；72℃延伸10 min。扩增产物经1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收产物送生工生物工程（上海）有限公司测序。

1.9 16S rDNA同源性分析 将所测分离菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中收录的序列进行比对，运用DNAStar软件将所测序列和参考序列进行比对和同源性分析并构建系统发育树。

1.10 小鼠致病性试验 将小鼠分为3组，每组设试验组（4只健康小鼠）和对照组（4只健康小鼠），将鉴定的停乳链球菌类马亚种、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌菌液培养物按0.1 mL/只（细菌浓度分别为1.64×108CFU/mL、2.04×108CFU/mL、1.78×1010CFU/mL）剂量腹腔注射小白鼠，对照组腹腔注射无菌液体培养基。各组接种后隔离饲养，每隔6 h观察一次小鼠的临床表现，连续观察1周。对各组出现症状及死亡的小鼠进行剖检观察，分离腹腔与病变脏器内细菌，并对分离菌进行鉴定。

2 结果

2.1 菌落形态观察结果 接种样本于血平板上37℃需氧及无氧培养24 h后，2、3、4号样本培养基均长出菌1、菌2、菌3三种菌落，1、6号样本培养基长出菌1、菌2两种菌落，5号样本培养基长出菌2一种菌落。菌1生长较快，培养12 h后已有明显菌落，菌落较大，有光泽，呈圆形凸起，颜色白色偏金黄；菌2生长较慢，在培养36 h后才出现较明显的形态，呈半透明状的细小菌落；菌3呈灰白色，表面光滑，有光泽的细小菌落；三种菌均出现溶血现象（图1）。

2.2 革兰氏染色镜检结果 将3株菌纯培养后进行革兰氏染色。镜检结果显示：3株菌均为革兰氏阳性菌；菌1呈单个、多个或呈葡萄状排列的球菌；菌2为两端钝圆短棒状杆菌；菌3呈球形或卵圆形，在固体培养基上生长，以1～6个形成短链状，且以单个或双个形式居多，液体培养基中多以6个以上形成长链状。根据分离地点和时间将其分别命名为GZGP2018-1、GZGP2018-2和GZGP2018-3（图2）。

图1 3种菌在血琼脂平板培养基上的菌落形态Fig.1 Colony morphology of three strains on blood agar plate medium

图2 革兰氏染色结果Fig.2 Gram stain results

2.3 生化鉴定结果 将分离到的细菌培养物接种至相应的生化鉴定管中，37℃培养12～48 h，记录分离菌株的各项生化试验结果，鉴定出GZGP2018-1、GZGP2018-2、GZGP2018-3的生化特性分别与金黄色葡萄球菌、停乳链球菌类马亚种和化脓隐秘杆菌的生化特征一致，结果见表1、2、3。

表1 菌株GZGP2018-1生化特性Table 1 Biochemical identification of Staphylococcus aureus

2.4 16S rDNA测序分析结果 以细菌总DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增片段大小约为1500 bp，结果见图4。测序结果与NCBI网站上已提交的序列进行BLAST比对，结果见表4。

2.5 细菌药敏分析结果 纸片扩散法对3株细菌进行药物的敏感性实验，结果见表5。由表可知，细菌对日常使用的大部分抗生素都有一定的耐药性，其中分离菌GZGP2018-1株对磺胺间甲氧嘧啶、氟苯尼考、头孢拉定敏感；GZGP2018-2株对青霉素、庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那、氟苯尼考和头孢拉定敏感；GZGP2018-3对磺胺间甲氧嘧啶、丁胺卡那、环丙沙星和头孢拉定敏感。GZGP2018-1与GZGP2018-3对青霉素类药物耐药，3株菌均对红霉素耐药。

表2 菌株GZGP2018-2生化特性Table 2 Biochemical identification of Streptococcus mutans

表3 菌株GZGP2018-3生化特性Table 3 Biochemical identification of pyogenic pyogenes

表4 猪体表脓包中细菌鉴定结果Table 4 Results of bacterial identification in pig pustules

图3 16S rDNA扩增结果Fig.3 Electropherogram of 16S rDNA amplification results

表5 分离菌株的药物敏感性Table 5 Drug sensitivity of isolated strains

2.6 16S rDNA同源性分析结果

2.6.1 GZGP2018-1 16S rDNA同源性分析 同源性分析结果显示，本试验分离所得GZGP2018-1株的16S rDNA与NCBI上的金黄色葡萄球菌菌株的同源性为99.7%～99.9%；且与金黄色葡萄球菌菌株1549-REV（GenBank登录号：LT992436.1）、CICC 10384（GenBank登录号：KJ643929.1）、F17SA003（GenBank登录号：CP031130.1）、GD1539（GenBank登录号：CP019594.2）、YR1（GenBank登录号：MH383083.1）的亲缘关系最近，同源性达99.9%（图4）。

2.6.2 GZGP2018-2 16S rDNA同源性分析 同源性分析结果显示，本试验分离所得GZGP2018-2株的16S rDNA与NCBI上的化脓隐秘杆菌菌株的同源性为99.5%～99.9%，且与化脓隐秘杆菌菌株M18（GenBank登录号：JN578121.1）的亲缘关系最近，同源性达99.9%（图5）。

图4 GZGP2018-1 16S rDNA系统进化树Fig. 4 Phylogenetic tree of GZGP2018-1 16S rDNA

图5 GZGP2018-2 16S rDNA系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of GZGP2018-2 16S rDNA

2.6.3 GZGP2018-3 16S rDNA同源性分析 同源性分析结果显示，本试验分离所得GZGP2018-3株的16S rDNA与NCBI上的停乳链球菌类马亚种菌株的同源性为99.6%～100%，且与停乳链球菌类马亚种菌株eNo.61（GenBank登录号：AB537922.1）的亲缘关系最近，同源性达100%（图6）。

图6 GZGP2018-2 16S rDNA系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of GZGP2018-2 16S rDNA

2.7 动物致病性结果 小鼠在人工感染分离菌株2 h后，开始出现精神沉郁、被毛凌乱、蜷缩成团等临床表现，对照组小鼠全部存活、无明显的临床症状。对死亡小鼠剖检采集病料，进行细菌分离、生化试验，结果显示细菌特性均与原分离菌相同（表6）。

3 讨论

猪脓肿的报道在我国相对较少，虽然近年来随着规模化猪场的扩大，该病发病率逐渐升高，但是由于其病死率较低，很容易被技术人员忽视。猪患猪脓肿后会出现精神不振、食欲降低等临床症状，并且行动不便，导致饲料的转化率降低，严重影响猪的生长发育和猪肉品质，对猪场的经济效益回报率影响较大。造成猪脓肿的原因有很多，常见如日常饲养管理混乱、圈舍卫生条件不达标、皮肤的机械性损伤等，病原菌侵入皮肤，形成皮下脓肿；养殖场人员在注射疫苗、药物时操作不当，也会导致猪的注射部位出现脓肿。

经调查，该猪场患猪脓肿的主要猪群为育肥猪和产猪，发病日龄3个月到3年不等，发病部位以腿部、颈部和臀部为主，每年患脓肿病的高峰期为6～7月。本研究从患猪脓肿脓汁中分离出了3株细菌，在通过形态学特征的观察和鉴定后，结合分子鉴定手段进行了种属分类，并通过动物回归实验对其致病性进行了研究。在对分离到的3株细菌进行同源性对比分析中发现，GZGP2018-1株16S rDNA与NCBI上的金黄色葡萄球菌的同源性为99.7%～99.9%，GZGP2018-2株16S rDNA与NCBI上的化脓隐秘杆菌的同源性为99.5%～99.9%，GZGP2018-3株16S rDNA与NCBI上的停乳链球菌类马亚种的同源性为99.6%～100%。结果表明该养猪场猪脓肿的脓汁中的病原菌主要是停乳链球菌类马亚种、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌。其中金黄色葡萄球菌是一种条件性人畜共患病原菌，也是引起化脓感染的最常见的病原菌，可引起仔猪渗出性皮炎、猪心膜炎、奶牛乳房炎和子宫内膜炎等多种动物的疾病，若治疗不及时，常引起败血症而死亡[5-6]；停乳链球菌类马亚种的报道较少，该菌可引发猪的关节炎、败血症，在大熊猫的局部化脓性感染中也有发现[7-8]；化脓隐秘杆菌在家畜之间的传播，可导致广泛多样性的皮肤、内脏器官和关节的非特异性化脓感染，如急性化脓性乳房炎、关节炎、心内膜炎等[9-10]；3种细菌均可导致感染动物发生不同程度的局部化脓病变，也是导致该猪场猪体表脓肿的主要原因。调查发现，青霉素、链霉素是该猪场对于猪疾病的治疗常用的药物，进而导致细菌对青霉素、链霉素耐药，结合本研究的药敏试验结果3株细菌总体对头孢拉定、环丙沙星、磺胺间甲氧嘧啶和氟苯尼考较敏感，该猪场饲养管理人员在临床上使用头孢拉定、氟苯尼考分别对猪脓肿进行治疗，表现出了较好的治疗效果。同时，养殖场还应注意强化饲养管理水平，做好对这3种细菌的消毒工作，消除此类细菌引发猪，特别是抵抗力较低的猪体表脓肿，进一步导致败血症、关节炎暴发或死亡的隐患。

本次研究对分离出的3株菌株致病性及药物敏感性进行了研究，并通过药敏试验筛选出部分对脓肿分离菌株有较好抑制作用的药物，为猪脓肿的防治工作及深入研究提供了数据支持。