对骨康灵液治疗骨折病人修复机制的研究

王琼仙,王金伟，曾跃勤,杨骐睿,韩娅南，陆发新，杨桂梅△,李成△

（1昆明医科大学实验动物学部，云南 昆明；2云南省骨科专科医院，云南 昆明；3昆明医科大学分子院，云南 昆明；4昆明医科大学公卫学院，云南 昆明；5昆明医科大学药学院，云南 昆明 ）

0 引言

骨康灵液是由昆明医学院科研中试中心经云南省药监局批准生产滇药制字(Z)20092434A的院内制剂。骨折后，机体需要一个较长的时间去进行修复，以实现骨折愈合[1]，而受到多种原因的影响，会有骨折延迟愈合或是不愈合的情况发生[2]。骨康灵液为外用药液，成分包含桃仁、续断、三七、红花等10余味中药[3]，有其独特的配方以及工艺流程方，对药材炮炙加工之后将药物粉碎，过120目筛，之后使用70%-95%酒精对药物进行浸泡过滤，将有效成分提取出来并制备成药液。该药物的制备方法集传统和现代为一体，为现代中药复方制剂，其主要作用是接骨生新，促进骨折端的骨痂生长，加速骨折愈合，并且能够活血化瘀，消肿止痛，舒筋壮骨，清心安神等，在跌打损伤、外伤闭合性骨折、关节红肿痛等方面的治疗效果较好。骨折愈合是一个很复杂的问题，受多种因素的影响[4]。院内制剂是医院药学的重要组成部分，在我国制药业的不断发展创新之下，对院内制剂造成较大冲击[5]。但是对于市面上没有的一些院内中药制剂，其作用不可替代，具有疗效确切、安全可靠和经济实惠的特点，符合我国目前的国情。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）为高度特异性的促进血管内皮细胞生长的因子，其能够增加血管通透性，促进血管内皮细胞增殖和血管生成；另外，还能够在骨-软骨细胞的分化过程中起到相应的调节作用，使骨的修复进程加快。要想实现骨折修复，需要大量新生毛细血管参与作用，而血管生成需要在VEGF导致血管通透性增加的前提下进行。在血管生成这一过程中，VEGF起到主导作用，其和血管内皮细胞上的特异性受体相结合，从而对血管内皮细胞的增殖和血管生产起到积极的促进作用，以此使骨折部位血管网得以建立，使骨折部位恢复血供，促进骨愈合。

骨折需要在膜内骨化与软骨化的过程中完成修复，而骨性骨痂与软骨骨痂的组成成分为小梁骨细胞和软骨细胞。本研究结果显示，骨折造模成功后第7d内，相比于成骨骨细胞、软骨细胞中VEGF在健侧肢体的表达水平，骨折侧均更高，表明在骨折愈合的整个过程中，VEGF表达持续发挥作用。中医学中，认为骨折发生后，导致局部气血瘀滞，进而影响全身血液运行，导致瘀阻不通，形成血瘀证。而骨康灵液的功效主要为活血化瘀、消肿止痛，并且能够促进骨痂生长，加速骨折愈合。本研究将大鼠作为实验动物建立骨折模型，发现对骨折大鼠使用骨康灵液后，骨痂内的VEGF表达显著升高，内皮细胞出现明显增殖，使血管加速生成，且骨-软骨细胞的分化速度加快，因此对于骨折部位的修复有显著的促进效果。

基于对文献的复习基础上，我们利用骨康灵液治疗闭合性骨折的实验性临床研究，同时寻找骨康灵液发挥作用是与骨痂生长和VEGF的表达变化相关。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2015年10月至2018年10月在云南省骨科专科医院收集到不同类型的外伤性闭合骨折患者900例，分别进行诊治，观察不同治疗方案下的临床疗效。其中699例患者纳入治疗组，治疗方案为小夹板固定结固定，在此基础上外用骨康灵液，201例纳入对照组，采取常规西医石膏固定的治疗方案。两组患者的骨折程度比较均衡，并根据患者自身骨折状况确定治疗时间。

1.2 药品

骨康灵液100ml/瓶，由昆明医科大学提供。使用医院云南省骨科专科医院。该医院具有专业的临床医生，且放射科X线摄片机等检查设备完善。

1.3 治疗方法

治疗组：X线摄片确诊→进行骨折复位→采取小夹板固定结方法进行固定，外用骨康灵液→进行复查→再次进行X线摄片。

对照组：X线确诊→复位（方法同上）→采取常规石膏固定→复查→再次X线摄片。

在进行治疗之前，需要通过X线摄片诊断患者的骨折情况，确定外伤闭合性骨折的类型，采取常规外科手法对骨折进行复位，之后进行如下治疗：（1）治疗组：使用薄药棉或纱布将患者的骨折部位包缠好，采取小夹板固定结固定，然后在包缠患处的药棉或纱布上浸入骨康灵液，4次/d，保持药棉湿润，使毛孔保持扩张状态，从而促进患处吸收药物，提升药效。（2）对照组：使用石膏进行骨折部位的固定。两组患者治疗后定期回院复查，10-15d/次或是听从医嘱上告知的时间，然后再次复查骨折部位的X线片，将其作为参考依据，对临床疗效、骨折愈合时间进行判断。

1.4 闭合性骨折动物模型建立、骨康灵液药效评价及潜在机制研究

1.4.1 动物的分组（animal and grouping)

选择成年SD大鼠，雌性大鼠和雄性大鼠各100只，共计200只，体重平均值为（200±20）g，随机将其分成如下4个小组：空白对照组（即假手术组）以各组大鼠的左侧为研究对象，骨折组和对照组(骨折+佐剂即95%酒精组)分别入选66只大鼠，并以其右侧作为研究对象，另外68只大鼠的右侧纳入到治疗组(骨折+骨康灵液组)。每组中有几只备用动物。实验动物的购入来源为昆明医科大学实验动物学部，质量合格证号为SYSK(滇)2005-0004，许可证号为SCXK(滇)2011-0004。

1.4.2 大鼠动物模型建立（animal model)与药物治疗

制备骨折模型：对入选的200只大鼠右侧股骨逆行穿克氏针进行固定之后，使用造模支架制造股骨中段骨折，并按照1.4.1中的动物分组方法实施分组，分别拍摄X线片进行观察。将模型大鼠伤口进行缝合之后，给予肌肉注射青霉素以预防感染，剂量为15万单位/（kg·d），共使用3d。

1.4.3 分组及给药

骨折造模成功后按照1.4.1中的动物分组方法随机分为4个组别，分别为空白对照组（假手术组）、骨折组、对照组、治疗组。其中治疗组使用骨康灵液，在患处包缠薄药棉或纱布[6]，之后实施小夹板固定结固定，并在患处药棉上浸入骨康灵液，4次/d，保持药棉湿润，这样有利于患处皮肤毛孔开放，从而加速药物的吸收；对照组实验动物使用小夹板固定后常规用95%酒精治疗，骨折组、空白对照组不进行药物治疗。按照常规喂养方法进行所有实验动物的喂养。

1.4.4 X线摄片观察骨痂生长及骨折愈合情况

在骨折造模成功并给予相应治疗的第7d、第14d、第21d、第30d、第42d、第50d分别随机从每组中抽取大鼠各10只，对其进行腹腔麻醉，然后拍摄X线片，进行骨痂生长、骨折愈合情况的观察，并进行评分。

1.4.5 评分标准

1分：骨折断端边缘趋向模糊，有轻度的骨膜反应，未见骨痂。

2分：骨折断端边缘模糊，有较浅的骨膜反应，可见少量低密度骨痂，边缘不整齐。

3分：骨折断端边缘趋向于消失，有较深的骨膜反应，骨痂增多，密度增大，边缘清晰，骨折缺损部位尚未填满。

4分：骨折断端边缘消失，骨膜反应密度与骨影十分相近，缺损部位被骨痂填满，与骨皮质连接，且二者密度相同。

X光摄片后，采用0.9%的生理盐水和4%的多聚甲醛灌注固定的方式，获取双侧股骨，将骨折部位的骨痂、周围软组织同时取出，另外将健侧同一水平面的股骨同组织也取出来，实施组织学处理并进行观察。

1.4.6 免疫组织化学方法检测VEGF的表达

OTC包埋取出的组织，然后将其放在恒温切片机中，设定为-20℃进行速冻，10 min后对组织实施切片处理，厚度为5-10μm，将切片后的组织展平，将其贴片在多聚赖氨酸或APS包被的玻璃片上，使用铅笔对切片做好标记，以备后续贴片染色，漂片置PBS烧杯备用。将贴片放在湿盒里面，使用移液枪吸取0.01mol/L PBS溶液，然后用组化反应板漂洗切片，每次漂洗5min，共计3次[5]。之后在37℃的条件下用5%羊血清进行孵育，时间为30min，使非特异性位点得以封闭。用一抗孵育（兔属性，1:100），4℃条件下过夜。需进行酶组化染色时，将酶标二抗加入，37℃条件下2h。PBS洗5min，共3次。之后将DAB底物加入，H2O2标色反应显色。常规梯度酒精脱水，中性树胶材片，使用光学显微镜进行观察并实施拍照。若为荧光，则用二抗孵育（Alexa 549，中杉金桥，羊抗兔，1:200；Alexa 488，Invitrogen，羊抗鼠，1:100），37℃条件下进行孵育，时间为1-2h，注意避光。空白对照使用2%羊血清代替一抗。漂洗使用0.01mol/L PBS溶液，每次5min，共漂洗3次，注意进行避光处理。之后使用DAPI复染细胞核，并在荧光显微镜下进行阳性反应部位的仔细观察[6]。通过免疫组织化学法进行组织中VEGF表达水平的检测，将每张切片通过镜下观察得到的阳性细胞数进行记录。若阳性细胞胞浆染色结果为棕色，高倍视野下进行染色阳性细胞计数，并对阳性率进行计数。

1.4.7 免疫组织化学方法检测VEGF的表达影响

（1）镜下记录每张切片的阳性细胞数。

（2）计数高倍视野内染色阳性细胞、计数阳性细胞率。

（3）确定骨康灵液在骨折愈合中对VEGF表达影响的机制研究。

1.5 统计学方法

SPSS软件作为本次研究各项结果数据的处理工具，其中计量资料以±s）的形式呈现，实施t检验，计数资料则开展χ2检验，等级资料用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效

2.1.1 疗效标准

（1）痊愈：骨折部位完全消肿，局部压痛、纵向叩击痛等完全消失，X线片显示骨折断端有丰富良好的骨痂生长，血肿机化被完全吸收，实现临床骨折完全愈合，功能完全正常。

（2）显效：骨折部位发红、肿胀、疼痛等不良症状消失，X线片显示骨折断端的骨痂生长情况较好，血肿机化吸收不完全，功能可有轻微影响，但基本正常。

（3）有效：临床症状、体征有所改善，但未完全消失，X线片显示骨痂生长情况尚可。

（4）无效：症状、体征无明显缓解，X线片显示骨痂生长状况不理想。

2.1.2 骨折愈合标准

骨折部位无痛感，如压痛、纵向叩击痛等均消失；活动完全恢复正常；X线摄片显示骨痂连续性生长并通过骨折线，骨折线模糊或消失；将外固定拆除之后，进行连续2周的观察，骨折部位未发生变形。

2.1.3 两组疗效比较

2.1.3.1 不同性别骨折部位比较

全部资料不同性别的骨折部位比较，差异无统计学意义（P=0.444），两组骨折部位基本相同。见表1。

表1不同性别骨折部位比较 [n(%)]

2.1.3.2 不同性别的疗效比较

全部资料不同性别的骨折治疗疗效比较，差异无统计学意义（P=0.066），两组骨折治疗效果基本相同。见表2。

表2 不同性别的疗效比较 [n(%)]

2.1.3.3 治疗组和对照组的性别比较

治疗组和对照组不同性别分布比较，差异无统计学意义（P=0.120），两组性别分布基本相同。见表3。

表3 治疗组和对照组的性别比较 [n(%)]

2.1.3.4 治疗组和对照组骨折部位比较

治疗组和对照组的骨折部位比较，差异无统计学意义（P=0.093），两组骨折部位基本相同。见表4。

表4 治疗组和对照组骨折部位比较 [n(%)]

2.1.3.5 治疗组和对照组的疗效比较

治疗组699例，痊愈561人，占80.3%，显效45人，占6.4%，有效37例，占5.3%，无效56例，占8.0%；对照组201例，痊愈69人，占34.3%，显效58人，占28.9%，有效18例，占9.0%，无效56例，占27.9%；治疗组和对照组的骨折治疗疗效比较，差异有统计学意义（P＜0.001），治疗组明显更优。分别统计两组的临床总有效率，治疗组的92.0%显著好于对照组的72.1%。治疗组总有效率高于对照组(见表5)。

表5 治疗组和对照组的疗效比较

2.1.3.6 治疗组和对照组的愈合时间比较

治疗组和对照组的愈合时间比较，差异有统计学意义（P＜0.001），两组骨折治疗临床愈合时间不同，治疗组临床愈合时间比对照组临床愈合时间短（提前13d左右临床愈合），1人提前13d左右临床愈合，699人（699×13d/人=9087 ）就提前了9087d好转，如果1人1天节约10元成本，699人就可以节约9万多元的经济开支。见表6。

表6 治疗组和对照组的愈合时间比较

表6 治疗组和对照组的愈合时间比较

注： z=-12.100，P＜0.001

组别 n 愈合时间 t P治疗组 699 34.20±8.60 -17.097 ＜0.001对照组 201 47.28±9.79

2.2 动物模型影像学实验结果

在动物模型造模成功并进行用药治疗后的各个研究时点分别对实验大鼠骨折部位进行X线摄片，观察骨痂生长、骨折愈合情况，分别评分。使用骨康灵液的治疗组评分均更优。见表7、图1。

2.3 动物模型VEGF实验结果

各不同观察时点每组大鼠的骨痂组织VEGF表达阳性细胞率结果见表8、图2。

3 讨论

3.1 临床实验

研究结果显示，骨康灵液治疗组和西医常规对照组的临床总有效率分别为92.0%、72.1%，表明使用骨康灵液进行治疗，有利于骨痂生长、血肿机化吸收，从而促进骨折愈合[7]。通

图1 各组大鼠各时间点骨痂组织造模后7-50d X 线影像评分结果柱状图

图2 各组大鼠各时间点骨痂组织VEGF表达阳性细胞率柱状图

表7 各组大鼠各时间点骨痂组织造模后7-50d X 线影像评分结果

表7 各组大鼠各时间点骨痂组织造模后7-50d X 线影像评分结果

组别 7d 14d 21d 30d 42d 50d骨折+骨康灵液组 1.68±0.51 2.29±0.37 3.43±0.47 3.99±0.49 4.19±0.34 4.49±0.48骨折+95%酒精组 1.03±0.48 2.01±0.29 2.99±0.29 3.48±0.23 3.63±0.30 3.68±0.32骨折组 0.20±0.09 0.30±0.18 0.40±0.29 0.50±0.38 0.70±0.39 0.90±0.49对照组 0.1 0.3 0.4 0.5 0.7 0.9

表8 各组大鼠各时间点骨痂组织VEGF表达阳性细胞率

注：*表示骨折+骨康灵液组与骨折+95%酒精组数据进行对比，P＜0.05，差异存在统计学意义

组别 7d 14d 21d 30d 42d 50d骨折+骨康灵液组 12.01±0.89* 20.10±1.28* 46.99±1.17* 41.09±0.80* 20.80±0.33* 5.49±0.32*骨折+95%酒精组 11.89±1.10 19.39±1.08 38.60±1.09 35.09±1.23 19.68±0.29 4.49±0.48骨折组 1.20±0.20 1.13±0.48 2.02±0.50 1.93±0.30 2.00±0.29 1.99±0.30对照组 0.1 0.3 0.7 0.6 0.3 0.2

过X线摄片判断两组患者的临床骨折愈合时间，相比于对照组，骨康灵液组时间提前13d左右。骨康灵液使用便捷，直接作用于患处，能够活血化瘀、消肿止痛、接骨生新，疗效确切安全，并且费用低廉，它的发明是对中医正骨科学的一大贡献[8，9]。

3.2 动物模型影像学实验

对造模成功并进行药物治疗后的各组大鼠分别在第7d、第14d、第21d、第30d、第42d、第50d实施X线摄片[10]。发现造模后第7d治疗组和对照组影像学表现差异不明显，治疗组骨折断端边缘趋向性模糊，轻度骨膜反应，未见骨痂[4]；第14d治疗组的骨折断端边缘明显模糊，有骨痂生长，但量较少，对照组未见骨痂，第21d，治疗组骨折断端骨密度增加，有逐渐加深的骨膜反应，骨痂增多，骨折线可见，对照组仅发现少量骨痂。第30d，治疗组的骨密度和骨膜反应均有加深，骨折断端被骨痂包绕，骨折线仍可见，对照组骨痂量增加。第42d，治疗组骨折线基本消失，骨膜和骨质的密度接近，缺损部位被骨痂填满，骨小梁力学结构趋向合理，对照组有较多的骨痂生长，骨折线比较清晰，骨小梁结构杂乱。第50d时X线摄片，骨折线消失，骨膜反应和骨影密度接近，骨痂密度同于骨皮质，二者连接紧密，将骨缺损处填满。结果表明，造模成功后第7d治疗组和对照组的影像学表现无明显差异(P＞0.05)，第50d治疗组骨痂生长和骨折愈合情况显著优于对照组[11]。表明骨康灵液有利于促进骨痂生长，更好地修复骨折部位。

3.3 动物模型VEGF实验

在造模成功用药治疗后各观察时点分别处死各组中的10只大鼠，实施组织切片免疫组织化学染色[12]，进行软骨细胞变化、骨痂中VEGF表达水平的观察。结果：4组中VEGF表达水平开始出现差异的时间为第7d，第14d差异更大，差异最大时点为第21d，并在第30d、第42d、第50d逐渐缩小差异，治疗组VEGF表达信号更强。结论：骨折愈合过程中软骨及骨性骨痂中均有VEGF表达[13]，说明VEGF参与骨折愈合，骨康灵液则对VEGF的表达水平有增高作用，从而利于骨折修复。

总之，骨康灵液对外伤闭合性骨折病人的治疗有较好的疗效[14]，它的骨折临床愈合治疗时间比西医常规治疗时间提前愈合；骨康灵液不仅能促使骨痂生长，同时还能提高VEGF的表达，利于骨折修复。