响应面法优化中性蛋白酶酶解海湾扇贝副产物制备抗氧化酶解物研究

胡 昂，段 蕊，刘志东，林 娜，张俊杰，李 磊，蒋 玫

（1.淮海工学院海洋生命与水产学院，江苏连云港 222005；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，上海 200090）

我国是扇贝养殖大国，2018年扇贝产量达到2.00×106t［1］。扇贝主要由扇贝壳、闭壳肌、外套膜、消化腺、鳃等部分组成［2］。目前，扇贝的主要食用部位为贝柱等，占扇贝总重较大的外套膜、消化腺等加工副产物因成分复杂、加工利用难度大等原因多作为废弃物处理。PADRAIGIN等［3］研究表明，扇贝加工副产物含有丰富的蛋白质等可利用物质，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抑菌、降血压等生物学功能。因此，扇贝加工副产物蛋白具有广阔的开发利用潜力。由于资源量巨大，海湾扇贝（Argopectenirradias）产业每年产生的扇贝加工副产物蛋白不仅造成了优质生物资源的浪费，还产生了环境污染问题。因此，扇贝加工副产物蛋白的深度开发利用已经成为扇贝产业亟需解决的主要问题之一。

正常情况下，人体的氧化-还原处于动态平衡状态；当人体处于应激和疾病状态时，这种氧化-还原平衡即被打破，人体表现出应激或者疾病状态。因此，氧化应激已经成为医学等领域研究的热点之一，进而带动了抗氧化物质的研究热潮。抗氧化肽通常是指具有2～30个氨基酸残基、有较强的清除自由基和抑制脂质过氧化或螯合过渡金属离子能力的生物活性肽［4］。此外，抗氧化肽还对由紫外线引起的线粒体损伤和自由基诱导的脂质过氧化具有明显的保护作用［5］。由于人们对人工合成抗氧化肽存在的潜在担忧，安全性更高的天然来源抗氧化肽受到广泛关注。田倩等［6］采用酶解法制备抗氧化肽，并对其进行分离纯化，以分离组分的总抗氧化性、DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力为评价指标，研究其在化妆品中的应用效果。邱春江等［7］利用木瓜蛋白酶酶解制备文蛤多肽，以羟自由基清除能力和超氧离子自由基清除能力为评价指标评价了其抗氧化活性。目前，扇贝抗氧化活性肽的评价指标多为单一抗氧化活性指标，选用DPPH自由基清除率和还原能力作为评价指标较少。

本研究基于扇贝加工副产物蛋白年产量大且尚未充分利用、天然来源抗氧化肽应用前景广泛的背景，以天然来源的海湾扇贝加工副产物为原料，采用中性蛋白酶酶解制备扇贝抗氧化酶解物。在单因素实验的基础上，采用响应面实验优化了海湾扇贝抗氧化酶解物的制备条件，并选用DPPH自由基清除率和还原能力两个指标（DPPH自由基清除率为主要评价指标）评价扇贝酶解物的抗氧化活性，以期为开发利用扇贝加工副产物蛋白和天然来源抗氧化肽提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用海湾扇贝2017年11月购自上海市杨浦区东方国际水产中心，中性蛋白酶（100 000 U·g-1）（上海源叶生物科技有限公司），无水乙醇、盐酸、2 000 mmol·L-1磷酸缓冲液（pH 6.6）、铁氰化钾、三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）、三氯化铁等购自国药集团，均为分析纯及以上。

1.2 仪器与设备

TGL-16M高速台式冷冻离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，河南巩义市予华仪器有限责任公司；AL204电子天平，上海精密科学仪器有限公司；PHS-3C型pH计，上海沪西分析仪器有限公司；721N型可见分光光度计，上海市精密科学仪器有限公司；HWS-24电热恒温水浴锅，上海沪西分析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 海湾扇贝加工副产物蛋白的提取

参考张莉莉等［8］方法略有改动。将海湾扇贝的贝柱取出，除贝壳外的其他物质视为海湾扇贝加工副产物，和95%乙醇分别放置于4℃冰箱预冷3 h以上，将预冷的95%乙醇缓慢倒入原料中，边加边搅拌（速度过快会导致共沉淀，局部变性），使物料比达到1∶10。1 mol·mL-1HCl或NaOH调节pH至7.0，放入4℃冰箱保存。次日，离心（8 000 r·min-1，10 min），取沉淀，再次加入预冷的95%乙醇，搅拌并加至物料比为1∶2，4℃ 冰箱储存。再次日，离心 （8 000 r·min-1，10 min），得到的沉淀即为海湾扇贝蛋白，于-20℃冰箱中冷藏待用。

1.3.2 海湾扇贝抗氧化酶解物的制备

海湾扇贝副产物蛋白溶散于蒸馏水，底物浓度为 20 mg·mL-1，搅拌溶解后用 1.0 mmol·L-1的NaOH溶液调节pH为7.0，加入中性蛋白酶，置于恒温加热磁力搅拌器中，开始酶解反应。水解过程中维持水解温度55℃恒定不变。水解完成后放入100℃水浴锅中水浴5 min灭酶。冷却至室温，4℃、10 000 r·min-1离心20 min取上清液，即为海湾扇贝蛋白副产物酶解物［9］。

1.3.3 DPPH自由基清除率的测定

参考刘媛等［10］方法略有改动。采用无水乙醇配制0.2 mmol·L-1DPPH溶液。将配制好的溶液置于避光处保存。样品稀释至不同浓度后备用。取样品及等体积0.2 mmol·L-1DPPH溶液加入同一试管中，摇匀，30 min后以无水乙醇为空白对照测定吸光度Ai，同时测定 0.2 mmol·L-1DPPH溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度Ac，以及样品与等体积无水乙醇混合液的吸光度Aj。按下式计算：

式（1）中：Ac为未加样品DPPH溶液的吸光度；Ai为加样品DPPH溶液的吸光度；Aj为样品在517 nm处波长的吸光度。

1.3.4 还原能力的测定

参考ZHOU等［11］方法略有改动。在试管中分别加入0.5 mL的样品。同时加入2.5 mL的磷酸缓冲液（0.2 mol·L-1，pH 6.6）和2.5 mL的1%铁氰化钾溶液，混合后放入50℃水浴20 min，再加入2.5 mL的10%的三氯乙酸溶液，室温静置10 min。吸取2.5 mL反应液，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL、0.1%三氯化铁溶液。反应10 min测定700 nm处吸光度，该值越高说明样品的还原能力越强。以0.1 mg·mL-1的BHA和BHT为阳性对照。按下式计算：

式（2）中：A0为未加样品DPPH溶液的吸光度。

1.3.5 半清除率的测定（IC50）

抗氧化剂清除能力利用清除DPPH自由基和还原能力的半清除率（IC50值）表示。将样品液配制成不同浓度溶液（1、2、3、4、5 mg·mL-1），测定其DPPH自由基清除率和还原能力。计算样品液浓度质量，按公式计算出IC50值。溶质质量所需浓度越低，表明半清除率越高。计算公式如下：

式（3）中：MDPPH表示测定 DPPH清除率消耗DPPH的质量；MR表示测定还原能力消耗试剂的质量，包括磷酸缓冲液、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁；M0表示加入样品溶液中溶质的质量。

1.3.6 海湾扇贝抗氧化酶解物制备的条件优化

1.3.6.1 单因素实验

以海湾扇贝加工副产物蛋白为原料，酶解步骤同1.3.2，开展单因素实验。以DPPH自由基清除率和还原能力为指标，比较酶解温度、酶解时间、底物浓度以及酶与底物比对海湾扇贝副产物蛋白酶解的影响。酶解温度影响：在酶与底物比1.2%、底物浓度20 mg·mL-1，酶解4.0 h的条件下，考察不同酶解温度（40、45、50、55、60℃）对海湾扇贝副产物蛋白酶解效果的影响。酶解时间的影响：在酶与底物比1.2%、底物浓度20 mg·mL-1、酶解温度55℃条件下，考察不同酶解时间（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h）对海湾扇贝副产物蛋白酶解的影响。底物浓度的影响：在酶与底物比1.2%、酶解温度55℃、酶解4.0 h的条件下，考察不同底物浓度 （14、17、20、25、33 mg·mL-1）对海湾扇贝副产物蛋白酶解的影响。酶与底物比的影响：在底物浓度20 mg·mL-1、酶解温度55℃、酶解4.0 h的条件下，考察不同酶与底物比（6.0、7.0、8.0、9.0）对海湾扇贝副产物蛋白酶解的影响［12］。

1.3.6.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken设计原理，采用三因素三水平响应面方法优化酶解过程中重要参数。响应面优化实验选取酶与底物比、酶解时间、酶解温度3个因素，选取-1、0、1代表自变量的3个水平，以酶解物的DPPH自由基清除率和还原能力建立响应面优化模型，共进行17组实验，其中12组为析因点，5组为区域中心点用于估算误差，每个实验重复3次。

1.3.7 数据统计与分析

采用Excel 2013、Origin 8.0软件处理实验数据，实验结果以“平均值±标准差”表示；Design Expert 8.0.6进行响应面优化实验。

2 结果与讨论

2.1 海湾扇贝抗氧化酶解物制备的单因素实验

2.1.1 酶解温度对海湾扇贝抗氧化酶解物制备的影响

不同酶解温度对海湾扇贝抗氧化酶解物的DPPH自由基清除率和还原能力的影响如图1所示。随着酶解温度的升高，酶解产物对DPPH自由基清除率呈现先增加后减小的趋势。当酶解温度低于55℃时，DPPH自由基清除率随温度升高逐渐上升，超过55℃时DPPH自由基清除率明显下降。这是因为一方面升高温度促使反应体系内的物质运动加快，从而提高底物与酶的接触机会，加速反应进程；另一方面，过高的反应温度使维持酶分子结构的次级链断开，导致酶活性降低，从而降低了酶解进程。酶解产物的抗氧化活性表明，与其他温度相比，温度为45℃和50℃时，酶解产物对抗氧化酶解物活性相对较低［13］，造成这一现象可能的原因：在这两个温度条件下酶解产物的结构被破坏，酶解成氨基酸或其他小分子肽，导致抗氧化基团含量下降，所以酶解产物的还原能力降低。其他温度条件下，酶解产物的DPPH自由基清除率在65%～75%之间，其还原能力也较接近。结果表明，在一定温度下，酶解产物具有合适且稳定的肽段长度和氨基酸比例，从而表现出良好的抗氧化活性。不同酶解温度的还原能力也不同，还原能力随酶解温度的升高呈现先下降后上升的趋势。综合考虑酶解温度对DPPH自由基清除率和还原能力的影响，确定酶解温度为55℃。

2.1.2 酶解时间对海湾扇贝抗氧化酶解物制备的影响

不同酶解时间对海湾扇贝抗氧化酶解物的DPPH自由基清除率和还原能力的影响如图2所示。酶解3.0 h和5.0 h的酶解产物对DPPH自由基清除率最低；酶解3.0～3.5 h时，酶解产物对DPPH清除率无显著差异；当酶解时间为4.0 h时，酶解产物对DPPH自由基清除率达到最大；之后随着酶解时间的增加，酶解产物的DPPH自由基清除率明显下降。这可能是由于酶解产物中的抗氧化酶解物随着酶解时间的延长，被降解成抗氧化活性较低的短肽或游离氨基酸，因此导致酶解液的抗氧化活性降低。酶解3.0 h和4.5 h的酶解产物还原能力最低。综合考虑酶解时间对DPPH清除率和还原能力的影响，确定酶解时间为4.0 h。

2.1.3 底物浓度对海湾扇贝抗氧化酶解物制备的影响

不同底物浓度对海湾扇贝抗氧化酶解物DPPH自由基清除率和还原能力的影响如图3所示。底物浓度在14～20 mg·mL-1之间，DPPH自由基清除率随底物浓度升高而上升；在20 mg·mL-1时，DPPH自由基清除率达到最高。这是因为，随着底物浓度的增加，酶与底物的接触几率增大，水解速率提高，产生的肽含量相应增加，从而导致DPPH自由基清除率提高。在25～33 mg·mL-1之间，海湾扇贝抗氧化酶解物对DPPH自由基清除率和还原能力的影响趋于稳定。这是因为，随着海湾扇贝蛋白含量的进一步增加，蛋白酶相对含量逐渐降低，酶解反应进程减慢，进而对酶解液的抗氧化活性无显著影响，因此，在后续的优化实验中没有将其作为主要影响因素考虑。在浓度为20 mg·mL-1时，DPPH自由基清除率最高为67.87%，还原能力趋于平缓，以DPPH自由基清除率为主要指标，选择浓度为20 mg·mL-1为宜。

图1 酶解温度对DPPH自由基清除率和还原能力的影响Fig.1 Effects of hydrolysis temperature on DPPH radical scavenging rate and reducing capacity

图2 酶解时间对DPPH自由基清除率和还原能力的影响Fig.2 Effects of hydrolysis time on DPPH radical scavenging rate and reducing capacity

图3 底物浓度对DPPH自由基清除率和还原能力的影响Fig.3 Effects of substrate concentration on DPPH radical scavenging rate and reducing capacity

2.1.4 酶与底物比对海湾扇贝抗氧化酶解物制备的影响

海湾扇贝抗氧化酶解物不同酶与底物比对DPPH自由基清除能力和还原能力的影响如图4所示。当酶与底物比在1.0%～1.4%时，DPPH自由基清除率随加酶量增加而显著上升；在1.4%时，DPPH自由基清除率达到最高。这可能是因为，随着蛋白酶用量的增加，海湾扇贝蛋白水解就会越充分，生成的抗氧化肽就越多，从而使DPPH自由基清除率提高。当酶与底物比在1.4%～1.8%时，酶解液的DPPH自由基清除率下降。这是因为，当酶含量达到一定程度，就会因为底物不足而引起水解反应速率的下降，进而导致自由基清除率下降［13］。以DPPH自由基清除率为主要指标，酶与底物比确定为1.4%。

2.2 响应面优化分析

在单因素实验基础上，以酶解时间、酶解温度和酶与底物比为自变量，以DPPH自由基清除率和还原能力为因变量，采用Box-Behnken设计优化抗氧化酶解物制备条件实验（表1）。

表1 响应面设计因子水平表Tab.1 Factors and levels in the response surface analysis

2.2.1 回归方程的建立

采用Design Expert 8.0.6软件处理，表2是Box-Behnken实验设计与结果。

图4 酶与底物比对DPPH自由基清除率和还原能力的影响Fig.4 Effects of enzyme-to-substrate on DPPH radical scavenging rate and reducing capacity

表2 Box-Behnken实验设计与结果Tab.2 Box-Behnken design and results

利用软件Design Expert 8.0.6进行多元回归拟合，得到回归模型Y1（海湾扇贝抗氧化酶解物DPPH自由基清除率）和Y2（海湾扇贝抗氧化酶解物还原能力）。响应值Y1剔除不显著AC、BC后对方程进行优化得到：Y1=69.63-5.88×A-3.57×B+0.30×C-2.75×A×B-1.08×A×C+1.76×B×C+3.54×A2+4.68×B2+1.72×C2。

响应值Y2剔除不显著AB、AC、BC后对方程进行优化得：Y2=62.05+2.61×A-1.41×B+2.43×C-0.065×A×B-0.95×A×C-0.99×B×C-4.22×A2-3.58×B2-3.40×C2。回归方程的方差分析结果见表3和表4。Y1的回归模型决定系数R2为0.988 6，说明DPPH自由基清除率的实际值与预测值拟合较好；调整决定系数RAdj2为0.851 0，表明该模型能解释85.10%的响应值变化［14］。该模型的P值小于0.001，表明该回归模型特别显著；模型失拟项为0.067 3，表明该模型失拟项不显著，说明该方程拟合度高，此回归模型可以用于预测酶解温度、酶解时间和酶与底物比对DPPH自由基清除率的影响。Y2的回归模型系数R2为0.954，说明还原能力的实际值与预测值拟合较好；调整决定系数RAdj2为0.796 5，表明该模型能解释79.65%的响应值变化；该模型的P值小于0.01，表明该回归模型极显著；模型失拟项为0.759 0，表明该模型失拟项不显著，说明拟合度高，此回归模型可以用于预测酶解温度、酶解时间和酶与底物比对酶解物还原能力的影响［15］。

表3中F值表示的是单因素对海湾扇贝抗氧化酶解物DPPH自由基清除率的影响程度，F值越大，表示影响越大。由3个影响因素的F值大小可以推断出3个因素对DPPH自由基清除率影响程度排序为A＞B＞C，其中因素A（酶解时间）、B（酶解温度）对DPPH自由基清除率影响特别显著，A2、B2对DPPH自由基清除率影响极显著（P＜0.01），AB对DPPH自由基清除率的影响显著（P＜0.05），C（酶与底物比）、AC、BC、C2的P＞0.05，表明其对DPPH自由基清除率无显著性影响。

表4中F值表示的是单因素对海湾扇贝抗氧化酶解物还原能力的影响程度，F值越大，表明其影响越大。由3个影响因素的F值大小可以判断出3因素对还原能力的影响程度排序为A＞C＞B，其中A（酶解时间）、C（酶与底物比）、A2、B2、C2对还原能力的影响极显著，AC影响显著，B（酶解温度）、AB、BC的P＞0.05，表明其对还原能力无显著性影响［16］。

表3 Y1响应面实验的方差结果分析Tab.3 Analysis of variance results of Y1 response surface test

表4 Y2响应面实验的方差结果分析Tab.4 Analysis of variance results of Y2 response surface test

采用Design Expert 8.0.6软件根据多元回归拟合分析处理3个因素对海湾扇贝抗氧化酶解物DPPH清除率影响的结果见图5～图7，对海湾扇贝抗氧化酶解物的还原能力影响的结果见图8～图10。分别固定各因素中的1个因素在0水平，得出其余2个因素的交互作用对海湾扇贝抗氧化酶解物的DPPH自由基清除率和还原能力影响的三维响应面图和等高线图，三维响应面图和等高线图可以直观地反映各因素对海湾扇贝酶解物抗氧化活性的影响。等高线是响应面在水平方向的投影，等高线的形状可以反映交互作用的大小、交互作用是否显著，椭圆等高线表示两因素交互作用显著，圆形等高线表示交互作用不显著。响应面坡度越陡，表明响应面对参数的变化越敏感，该参数对实验结果的影响越大；反之，响应面坡度较平缓，表明响应面对参数的变化不敏感，该参数对实验结果的影响不显著。由图5～图7可知，交互项中酶解时间与酶解温度对DPPH自由基清除率的响应面坡度最陡，表明酶解时间与酶解温度对实验结果影响最大；时间和酶与底物比之间交互的等高线图成圆形，表明酶解时间和酶与底物比的交互作用影响较小，这与二次回归方程的结果相一致。

由图8～图10可知，交互项中酶解时间和酶与底物比对还原能力的响应面坡度最陡，说明酶解时间和酶与底物比对实验结果影响最大；酶解温度和酶解时间之间交互的等高线成圆形，说明酶解时间和酶解温度的交互作用可以忽略，这与二次回归方程的结果相一致［17］。

2.2.2 模型的优化和验证

基于单因素实验，利用响应面优化实验得到海湾扇贝抗氧化酶解物的最佳制备条件为：酶解时间 3.82 h、酶解温度 50℃、酶与底物比1.54%、底物浓度20 mg·mL-1，在此条件下，海湾扇贝抗氧化酶解物的DPPH自由基清除率为81.93%，还原能力为58.92%，DPPH自由基清除率的IC50值为0.264 mg·mL-1，还原能力的IC50为3.136 mg·mL-1，具有较高的抗氧化活性。与张一江等［18］利用海湾扇贝为原料制备扇贝酶解物（DPPH自由基清除率的IC50值为5.90 mg·mL-1）相比，DPPH自由基清除活性更高；与田友昊等［19］利用中性蛋白酶水解扇贝裙边制备抗氧化酶解物（IC50值为1.34 mg·mL-1）相比，DPPH自由基清除活性更高，还原能力活性则略低。其原因可能是由于田友昊等［19］所用样品的纯度更高，而张一江等［18］与本实验相似，样品为酶解混合物。综合考虑现实操作的可行性，进一步优化海湾扇贝抗氧化酶解物的较佳制备条件为：酶解时间3.8 h、酶解温度50℃、酶与底物比1.5%、底物浓度20 mg·mL-1。为检验回归模型预测的可靠性，在此条件下重复3次进行海湾扇贝抗氧化酶解物制备验证实验［20-21］。海湾扇贝蛋白酶解物的DPPH自由基清除率为83.47%（n=3），与预测值误差为1.26%；还原能力达到58.12%（n=3），与预测值误差为0.80%；实际值与预测值较一致。实验结果表明该回归模型在实验范围内能够较准确的预测海湾扇贝抗氧化酶解物的制备条件。

图5 A（时间）B（温度）两因素交互作用对DPPH清除率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots and contour plots of the interactive between A（time）and B（temperature）factors on DPPH radical scavenging rate

图6 A（时间）C（酶与底物比）两因素交互作用对DPPH清除率影响的响应面图Fig.6 Response surface plots and contour plots of the interactive between A（time）and C（enzyme to substrate ratio）factors on DPPH radical scavenging rate

图7 B（温度）C（酶与底物比）因素交互作用对DPPH清除率影响的响应面图Fig.7 Response surface plots and contour plots of the interactive between B（temperature）and C（enzyme to substrate ratio）factors on DPPH radical scavenging rate

图8 A（时间）B（温度）两因素交互作用对海湾扇贝抗氧化酶解物还原能力影响的响应面图Fig.8 Response surface plots and contour plots of the interactive between A（time）and B（temperature）factors on the reducing capacity

图9 A（温度）C（酶与底物比）两因素交互作用对海湾扇贝抗氧化酶解物还原能力影响的响应面图Fig.9 Response surface plots and contour plots of the interactive between A（time）and C（enzyme to substrate ratio）factors on the reducing capacity

图10 B（温度）C（酶与底物比）两因素交互作用对海湾扇贝抗氧化酶解物还原能力影响的响应面图Fig.10 Response surface plots and contour plots of the interactive between B（temperature）and C（enzyme to substrate ratio）factors on the reducing capacity

3 小结与展望

本研究以DPPH自由基清除率和还原能力为响应值，在单因素实验的基础上（优选酶解时间4.0 h、酶解温度 55℃、酶与底物比 20 mg·mL-1、底物浓度1.5%），根据显著性确定以酶解时间、酶解温度和酶与底物比3个因素为自变量，采用响应面法优化确定海湾扇贝抗氧化酶解物的最佳制备条件为：酶解时间3.8 h、酶解温度50℃、酶与底物比1.5%、底物浓度20 mg·mL-1；海湾扇贝抗氧化酶解物的DPPH自由基清除率为81.93%，还原能力为58.92%，分别与预测值误差为1.26%和0.80%；DPPH自由基清除率的IC50值为0.264 mg·mL-1，还原能力的IC50值为3.136 mg·mL-1，具有较高的抗氧化活性，实际值与预测值具有较好的一致性。结果表明该回归模型在实验范围内能够较准确的用于预测海湾扇贝抗氧化酶解物的制备条件。目前，本研究获得的海湾扇贝抗氧化酶解物仍是混合物，抗氧化的主要组分与结构尚不明确，下一步将对其主要成分进行分离和纯化，探讨其抗氧化的作用机理。