龙须菜多糖的提取纯化及生物活性研究进展

王晓梅，张忠山，周俊波，潘伟成，孙斯麒，徐年军

（1.湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州 313000；2.宁波大学海洋学院，浙江宁波 315211）

龙须菜（Gracilarialemaneiformis）属杉藻目（Gigartinales），江蓠科（Gracilariaceae），江蓠属。藻体中含有丰富的碳水化合物、蛋白质、脂肪等营养成分。主产地分布在中国山东、辽宁、江苏、福建等省［1］。近年来，学者对龙须菜进行营养成分分析表明，其营养价值非常高［2］。研究发现，龙须菜内多糖含量占藻体干重的比例超过30%，龙须菜多糖的多种优异活性也逐渐引起学者的重视［3］。因此，本文对龙须菜多糖的提取纯化方法及生理活性研究进展进行了综述，以期为龙须菜多糖的应用开发提供参考，并为龙须菜的高值化综合利用提供借鉴。

1 龙须菜多糖的提取

龙须菜藻体较其他藻类坚硬，进行多糖提取时困难较大。因此，寻找一种能有效提高多糖得率及其生物活性的提取方法非常重要。目前，龙须菜多糖的提取方法主要有溶剂浸提法、物理辅助提取法、酶解浸提法等。

1.1 溶剂浸提法

龙须菜多糖是极性大分子，含大量的羟基，易溶于水。采用稀酸、稀碱与热水进行抽提是常见提取方法，其中，热水提取法是近年来提取龙须菜多糖常用的方法。有研究表明，江蓠属红藻粗多糖的胶体类型和非胶体类型在结构、溶解度以及生理活性等方面差别很大［4］。史晨杉等［5］发现从龙须菜中提取的粗多糖通过冷冻后溶解可以形成胶体多糖和非胶体多糖。实际上，两者仅在硫酸基团和3，6-内醚半乳糖的含量方面存在差异。朱地琴等［6］将50℃水提的龙须菜粗多糖进行冻融，获得胶体和非胶体两种多糖，发现胶体多糖的溶出率和多糖含量均显著高于非胶体多糖，但是后者的免疫活性极显著高于前者。然而，大多数研究者未对胶体多糖和非胶体多糖加以区分，仅按照混合多糖进行处理，提取工艺上稍有差异。如杨永利等［7］水提获取龙须菜多糖时优选方案为提取温度100℃、提取时间4 h、料液比1∶100、醇沉浓度60%，多糖得率34.6%。由于水提最佳工艺有所差异，使得龙须菜多糖的得率范围较大，为9%～30%不等［8-11］。

酸提法中以柠檬酸提取法为主。游丽君等［12］比较了柠檬酸、热水、超声、超声协同等4种提取方法得到的多糖的性质，发现柠檬酸法下多糖的得率最高，达到（17.81±0.34）%。获得的多糖分子量和粘度较低，且分子量的均一性较高，因此认为柠檬酸提取法是一种提取龙须菜多糖的更有效的方法［12-14］。

碱处理是龙须菜琼胶生产过程中的关键工序，处理后再用热水提取得到的龙须菜多糖主要是琼胶多糖。史晨杉等［5］发现碱处理后水提得到的龙须菜非琼胶多糖的抗氧化活性降低。这是由于碱处理后多糖中硫酸基含量大大降低，说明琼胶糖分子中的硫酸基含量与抗氧化活性密切相关。薛志欣等［15］采用相同工艺得到含微量硫酸基的龙须菜琼胶多糖。FAN等［16］用3 mol·L-1浓度的NaOH溶液在室温条件下提取龙须菜琼胶多糖的得率是2.06%，经HPGPC检测得到两个峰，其中主峰分子量为1.37×106 Da。

1.2 物理辅助提取法

最近几年发展起来的超声波技术越来越多的被应用到植物多糖的提取中。郭守军等［17］对超声波辅助提取龙须菜多糖的工艺进行了优化，发现影响多糖提取的主要因素依次为超声波提取温度＞功率＞提取时间。在正交实验最优条件下验证提取多糖得率最高可达24.23%。杨华［18］比较了超声波和热水浸提2种工艺，结果表明，超声波提取优于热水提取，其提取率最高达到29.75%，大于热水提取率的19.60%，可见超声波提取的明显优势。

微波是一种超高频电磁波，非常容易穿透和破碎藻类细胞，可以大大提高多糖的提取率。杨华和杨震峰［19］通过开展微波浸提影响因素的正交实验，确定最佳工艺参数为：微波功率600 W、提取时间6 min、水与龙须菜质量比100∶1，提取率达到27.60%。颜晓琳和刘杨［20］对龙须菜多糖双波辅助提取工艺进行响应面法优化。发现在超声波50 W、提取时间31.7 min、微波温度87℃、料液比1∶60.7条件下龙须菜多糖提取率为34.84%。证明将超声波与微波结合提取多糖效果会更佳。

冻融法是近年来兴起的一种利用冻结解冻过程中的冰晶作用破壁的方法，它与超声波处理都属于物理破壁技术。LIU等［21］通过冻融超声辅助提取优化最佳工艺为冻融次数2次、料液比1∶25、超声功率320 W、超声时间10 min，多糖得率为30.54%，该方法是一种效率高、成本低的提取方法。

1.3 酶解提取法

利用酶的催化性高、专一性强及仅需温和的反应条件等特点，将其应用到龙须菜多糖的提取过程中，可以促进藻体细胞壁的分解，加速细胞间质多糖的溶出。竺巧玲等［22］用1.5%纤维素酶提取龙须菜多糖，通过优化提取工艺获得的龙须菜多糖的提取率高达34.79%。WU等［23］采用α-淀粉酶辅助优化龙须菜多糖提取工艺，发现在pH=5、温度95℃提取40 min的条件下多糖得率可达49.15%，是目前已有文献报道中得率最高的方法。

另外，由于龙须菜多糖中的硫酸基团是阻碍琼胶分子形成凝胶的关键因素，因此寻找脱除硫酸基的方法是制备高质量琼脂的发展方向。殷勤等［24］利用重组芳香基硫酸酯酶水解海藻龙须菜中的硫酸基团，在最佳工艺条件下脱除了78.4%的硫酸基团，凝胶强度提高2.1倍，表现出较高的活力。

综上研究发现，目前应用最广泛的是溶剂浸提法，该方法中的水提法不使用酸碱，对设备损耗小、成本低，最适合工厂化生产；酸提和碱提法会得到结构新颖的多糖片段，但对设备腐蚀严重。物理辅助提取法提取效率高、分离纯化流程方便，但成本较高。酶解浸提法过程温和，提取效率高，适合工厂化生产，但专一性酶缺乏，无法普遍使用。

2 龙须菜多糖的纯化与结构解析

龙须菜同江蓠属中其他多糖类似，都属于琼胶类型，即由（1-3）-β-D-半乳糖与（1-4）-3，6-内醚-α-L-半乳糖交替连接的琼二糖重复单元组成。如果提取与纯化方法不同，所得龙须菜多糖硫酸基和甲氧基的数量和位置均不同［25］。CHIRAPART等［26］发现日本龙须菜多糖主要由琼二糖、琼胶糖前体组成，6-O-甲基-琼二糖含量较高，还有少量的2-O-甲基-L-半乳糖。

由于龙须菜多糖属于带电荷的杂多糖，因此常用葡聚糖凝胶或离子交换树脂进行分级纯化。卢佳芳等［27］采用DEAE-Sephadex A-25离子交换层析纯化得到龙须菜多糖的3个组分G1、G2和G3，分子量分布在2万至6万U之间。主要组成单糖为半乳糖、3，6-内醚半乳糖及少量葡萄糖，糖链通过1→2键与1→6键方式连接，或者通过1→3键与1→2键方式连接。薛志欣等［15］将龙须菜琼胶多糖依次经DE-22和Sephadex G-200柱层析纯化，得到一种含微量硫酸基的琼胶多糖，此多糖经Q-Sepharose柱层析鉴定为单一组分，但未对结构做进一步详细研究。

宫春宇等［28］采用 DEAE-Sepharose F.F.柱层析和Sephacryl凝胶层析方法，系统纯化龙须菜粗多糖，最终得到分子量为9.3×104Da的均一多糖GCpF1-1B。该多糖中半乳糖、果糖和葡萄糖醛酸组成比例为 14.28∶3.85∶1。WEN等［14］采用DEAE-Sepharose F.F.柱层析分离纯化柠檬酸提取龙须菜粗多糖，得到 GLP-1到GLP-5等5个组分。其中，GLP-1较为特殊，基本上由葡萄糖组成（90.76%）；GLP-2和GLP-3则含较多的半乳糖、葡萄糖以及少量鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖；而GLP-4和 GLP-5相似，均不含阿拉伯糖和甘露糖。

由于目前对龙须菜多糖精细结构的报道还比较少，比如支链的链接方式、单糖的链接位置等都不清楚，需进一步深入研究。

3 龙须菜多糖的生物活性

3.1 抗肿瘤活性

龙须菜多糖抗肿瘤机制是目前生物活性中研究较多的，表现在直接和间接抑瘤活性。分子量对龙须菜多糖抗肿瘤活性影响较大。张昆［29］将由热水提取法提取的TP和FGP两种多糖用氧化还原法降解获得8个不同分子量的多糖，发现未经降解的 TP（分子量为83 400）的抑瘤作用最强，随着多糖分子量的降低，抑制作用先逐渐减小然后增大，至分子量为17 571时（TP5）抑瘤作用又达到最强，之后多糖若继续被降解，其对Hela癌细胞的抑制作用又呈现降低的趋势。

龙须菜多糖可以通过直接抑制细胞凋亡发挥抗肿瘤活性。KANG等［30-31］将三氯乙酸法提取的龙须菜多糖作用于肺癌A549细胞后，随着作用浓度及时间的增加，癌细胞增殖能力及存活率逐渐降低，抑制率逐渐增加，细胞形态发生不规则改变，接触生长状态减少，数量减少，细胞核受到损伤，细胞发生凋亡，72 h后上述改变更为明显。

龙须菜多糖还可以通过免疫调节作用达到体内抗肿瘤效果。FAN等［32］发现龙须菜酸性多糖增强了荷瘤小鼠免疫器官的免疫功能，同时能够有效调节小鼠白细胞和淋巴细胞的激增，显著增强荷瘤小鼠T细胞和B细胞的增殖能力，提高脾NK细胞的杀伤活性。

抗氧化作用也是龙须菜多糖抗肿瘤活性的机制之一。陈美珍等［33］发现龙须菜多糖能显著降低荷瘤小鼠肝匀浆中脂质过氧化LPO含量，在灌胃剂量为150 mg·kg-1时抑瘤率可达到63.56%。

复合多糖往往具有抑瘤增效作用。谢好贵等［34］发现由龙须菜多糖、坛紫菜多糖和毛头鬼伞多糖以质量配比为6∶6∶3复配组成的复合多糖，当剂量为1 000μg·mL-1时，对人宫颈癌HeLa细胞抑制率达76.30%，分别高于同剂量的3种单一多糖。该复合多糖能提高凋亡蛋白酶基因caspase-10、caspase-3表达水平，诱导细胞凋亡。

龙须菜多糖抗肿瘤活性机制并不是独立的，是多个靶点综合的结果，其具体分子机制有待于进一步研究。

3.2 免疫调节活性

藻类多糖的免疫调节活性是藻类药理研究的热点。龙须菜多糖的免疫调节活性主要表现在免疫增强或免疫刺激，显示出多方面的调节活性，包括对巨噬细胞、炎症因子、NK细胞等的影响。

龙须菜多糖对巨噬细胞的调节作用比较显著。宫春宇等［28］发现龙须菜多糖在体外可以有效激活小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMMs），且呈现良好剂量依赖关系。当在高浓度500μg·mL-1条件下，激活率为420%。陈美珍等［35］发现龙须菜天然多糖能显著提高巨噬细胞的吞噬活性（P＜0.05），当增加或脱去硫酸根时，免疫活性均下降，尤其脱去硫酸基后下降更明显。

龙须菜多糖对炎症因子的影响效果明显。任颖朗等［13］发现由柠檬酸提取的龙须菜多糖能降低光老化小鼠血清白介素-10的含量，提高小鼠血清肿瘤坏死因子-α的含量，说明该多糖能缓解光老化小鼠的免疫抑制作用。REN等［36］发现酸提取纯化的龙须菜多糖GLP-2能通过激活巨噬细胞 RAW264.7的iNOS、IL-6和TNF-α的表达而显示出优异的抗炎活性。

龙须菜多糖对其他免疫细胞也有调节作用。范艳丽等［37］分析当效靶比为20∶1时，龙须菜酸性多糖GLSPs高剂量组小鼠的NK细胞杀伤能力较空白组小鼠显著增高（P＜0.05），杀伤率近90%，同时使小鼠白细胞和淋巴细胞略有增加，表明GLSPs对非特异性免疫应答具有明显的调节作用。

龙须菜多糖具有抗过敏活性。时超岚等［38］通过腹腔注射龙须菜寡糖能显著降低过敏小鼠血清特异性IgE和IgG1水平，提高特异性IgG2a水平（P＜0.05）。通过灌胃能显著降低小鼠粪便中组胺水平（P＜0.05），且能有效缓解空肠组织过敏病理现象。小鼠脾淋巴细胞实验结果显示，该寡糖能在转录和转译水平上显著降低Th2细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）含量（P＜0.05），促进Th1细胞因子IFN-γ分泌。说明龙须菜寡糖能有效调节辅助性T细胞的免疫功能向Th1细胞转换，从而抑制Th2细胞主导的食物过敏反应。

多糖普遍具有免疫增强活性，研究多糖的免疫活性将为开发免疫增强剂或保健品提供理论基础。由此可见，龙须菜多糖具有较强的应用前景。

3.3 抗氧化活性

多糖结构具有还原性的半缩醛羟基，可以还原自由基，最终达到清除自由基的目的。近年来的研究表明，龙须菜多糖具有优异的抗氧化活性。

分子量对龙须菜多糖的抗氧化活性有一定影响。杨文鸽等［39］研究发现在清除超氧阴离子自由基、DPPH自由基和还原Fe3+方面，龙须菜多糖的抗氧化活性随分子量的降低而增强，而在清除羟基自由基方面，抗氧化活性却随多糖分子量的降低而减弱。

碱处理对龙须菜多糖抗氧化活性影响较大。史晨杉等［5］研究发现经过碱处理后，龙须菜多糖对清除羟自由基和超氧阴离子、抑制卵黄脂质过氧化和小鼠红细胞氧化溶血的影响低于未经过碱处理的多糖。这是由于碱处理后多糖中硫酸基含量大大降低，而硫酸基是抗氧化活性降低的主要原因。

提取工艺不同，得到的龙须菜多糖结构也不同，抗氧化能力也会不一样。竺巧玲等［40］发现利用复合酶法提取的龙须菜多糖具有较强的清除羟自由基能力，微波提取的多糖具有较强的Fe3+还原能力，而超声波法提取得到的多糖具有较强的清除超氧阴离子能力，认为这可能与其含有的硫酸基团以及分子量分布有关。

龙须菜多糖具有对机体细胞氧化损伤的保护能力。SHI等［41］发现分级纯化的龙须菜多糖GCP-2对H2O2诱导的脾细胞损伤保护作用可达到92.8%。DI等［42］研究显示龙须菜多糖分级组分GRPS-3-2和GRPS-2-1能极显著增加H2O2诱导的神经细胞PC-12的增殖率（P＜0.01），最高可达75%以上。GUO等［43］将龙须菜多糖与草酸诱导的人近端肾小管上皮细胞（HK-2）共同孵育后，其细胞活性和SOD活性明显升高、LDH和MDA含量显著降低（P＜0.05），表明龙须菜多糖能通过抑制草酸诱导的脂质过氧化反应和提高细胞内抗氧化酶活性减少细胞损伤。

虽然龙须菜多糖明确的抗氧化机制仍待深入研究，但其优异的抗氧化活性为其开发成为抗氧化剂提供了参考。同时，抗氧化活性也是众多其他生物活性的重要作用基础，为解释相关生物活性原理提供了理论依据。

3.4 其他活性

目前报道的海藻多糖普遍具有降血糖活性。WEN等［14］研究了龙须菜多糖对链脲佐菌素诱导的2型糖尿病小鼠的影响，发现其可显著降低糖尿病小鼠的血糖水平、提高胰岛素分泌水平、减轻胰岛β细胞的损伤、增加β细胞数量，表现出优异的降糖活性。

在抗病毒方面，龙须菜多糖也表现出显著活性。CHEN等［44］发现龙须菜多糖的硫酸基含量在13%时，抗人流感病毒H1-364的能力最强。一旦超过或小于此含量时其抑制病毒作用均下降。

利用多糖的特殊结构和性质合成纳米材料已成为纳米材料制备领域的新兴课题。HE等［45］以龙须菜多糖为模板，设计合成了多糖-二氧化钛复合薄膜。活性实验表明，该复合薄膜能有效抑制大肠埃希菌（Escherichiacoli）与金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的生长，并且在包装圣女果后起到营养保持与品质改善效果。JIANG等［46］在构建纳米硒（SeNPs）靶向体系基础上，用龙须菜多糖进行修饰，该复合纳米体系能够显著提高对整合素αvβ3靶向能力，从而提高其抗脑胶质瘤U87和C6活性，降低其毒副作用。以上表明，龙须菜多糖是一种优良的药物载体材料。

龙须菜多糖也具有抗突变活性。陈美珍等［47］发现，龙须菜多糖能有效抑制环磷酰胺诱发的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核和精子畸变。在4 g·kg-1剂量时，微核抑制率达到最大，超过89.8%。

龙须菜多糖在食品加工领域也有应用。杜佳佳等［48］发现添加了脱除酸性多糖的龙须菜纤维粉能使猪肉肠的蒸煮损失率和离心失水率分别下降95.27%和71.62%，且随着龙须菜粉添加的增加保水效果逐渐增强。表明龙须菜粉可以作为一种天然保水剂来替代磷酸盐改善猪肉肠的品质。

4 小结与展望

近年来关于龙须菜多糖的研究报道越来越多，从提取、结构解析到生物活性等方面都取得了显著进展。但是也存在一些问题，比如：龙须菜非琼胶多糖的工艺改进不够稳定；对龙须菜多糖的药理活性机理的研究不够深入；新活性的扩展研究不够多；在食品和化妆品等领域的应用还未实现产业化，等等。未来，国内外学者可在上述方面加强研究，对琼胶多糖与非琼胶多糖加强区分、大力开拓龙须菜多糖的应用范围、综合开发龙须菜的保健与食品价值，以提升龙须菜的附加值。