船舶噪声声压级对大黄鱼幼鱼游泳、摄食行为及免疫生理指标的影响

林听听，刘 鑫，王昌勃，张 东

（中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090）

鱼类行为学是一门古老而又年轻的学科，是探索和研究鱼类对外界诱导或刺激所产生的反应行为和行为变化规律的基础学科。鱼类行为学广泛应用于渔业生产中［1-2］。例如，鱼类正趋向行为特征在养殖中有助于鱼类驯养，在捕捞上有助于诱集鱼群；而负趋向行为特征在渔业上可作为指示鱼类受到环境应激或者生物干扰的先兆，从而达到早发现、早预防的目的。近些年，随着人类对海洋开发的深入，人为的水下噪声源也日益增多。这些水下噪声源主要来自航运船只、声呐和沿海港口、航道、隧道的施工建设，以及海上钻井和海上风电场的施工作业等。水下噪声严重威胁着许多鱼类及海洋哺乳动物的健康和生殖能力，尤其是一些高强度的噪声会导致海洋动物听觉缺失甚至死亡［3-4］。

大黄鱼（Larimichthyscrocea）是我国目前养殖规模最大的海水鱼类，是我国出口八大优势养殖水产品之一，在我国水产养殖业中占有重要的地位［5］。但是，由于过度捕捞，野生大黄鱼种群受到严重破坏。虽然近年来大力开展休渔和人工增殖放流等措施，以期恢复大黄鱼的渔业资源，但收效甚微，大黄鱼的种质资源恢复缓慢，至今仍无法形成有规模的渔汛。导致该现象的原因之一可能与日益增长的水下噪声有关：噪声污染可能将大黄鱼驱离其栖息地而导致低成活率；也有可能是噪声直接对大黄鱼尤其是幼鱼产生物理性伤害而导致低成活率。施慧雄等［6］就报道了大黄鱼经船舶噪声干扰后其体内的皮质醇激素响应极为迅速，20 min就出现了峰值；另外，翁朝红等［7］也报道了大黄鱼无论是鱼苗还是成鱼对外界惊扰特别敏感和激烈，只要有异常的惊扰就会四处背离急游，而致体力耗竭或撞壁损伤等，严重时倒浮水中。

鉴于以上研究背景，本文以养殖大黄鱼幼鱼为研究对象，以产卵场附近常见船舶航行时所致的噪声为刺激源，确立幼鱼对噪声的敏感阈值，观测不同声压级强度刺激下幼鱼的游泳、摄食行为及部分免疫生理指标的变化，以期为制定大黄鱼产卵场的保护措施提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 船舶噪声源的录制

船舶噪声源于2015年10月在浙江岱山港，用水听器（C55；Cetacean Research Technology，Seattle，WA，USA；frequency range：20 Hz-44 kHz±3 dB；sensitivity：-165 dB re 1V·μPa-1）在1 500 t货轮满载经过时现场录制而成。水听器置于水下4 m，距船舶水平距离约50 m。录制的声信号经水听器由声压变电压信号，经电压前置放大器放大和滤波之后，以.wav的格式存储于高频数字录音机。经DTDiskTM软件和SIGNALTM软件分析得出，船舶噪声频谱范围为50 Hz～10 kHz，其主峰位于430 Hz处，水听器录制点船舶经过时的噪声声压级为98.6 dB，无船舶经过时的噪声声压级为62.2 dB（图1）。根据大部分石首鱼科的听觉阈值（90～100 dB）［8-10］，本文所录制的船舶噪声不在大黄鱼的声信号遮蔽之内，能干扰到大黄鱼。

1.2 实验用鱼

本研究于2016—2017年期间在中国水产科学研究院东海水产研究所福鼎试验基地进行。实验所用的大黄鱼幼鱼［体长（10.5±0.8）cm］分批次购自宁德市官井洋大黄鱼养殖有限公司。运至基地后，将幼鱼暂养于直径为6 m、深度为1 m的玻璃钢养殖桶中，每桶200尾，养殖水温23～24℃。暂养期间，每天换水1/2，早、中、晚各投喂一次浮性膨化颗粒配合饲料。投喂时，将饲料投于固定在养殖桶水面圆心处的浮筐（直径为60 cm）中，以防止饲料漂散。投喂1 h后，未摄食完的饲料用捞网捞出。待幼鱼摄食和排便均正常后（暂养驯化约3～4周），开始用于实验。

图1 浙江省岱山港货轮满载经过时的水下声音频谱图Fig.1 Sound pressure spectrum level of cargo ship passing by and ambient noise in Daishan Port，Zhejiang Province

1.3 噪声声压级对幼鱼游泳行为的影响

实验在直径为6 m、深度为1 m的玻璃钢养殖桶中进行。养殖桶水面圆心处设有一个浮筐，用于投饵；养殖桶桶边12点钟方向安有连接于噪声源的水下扬声器；养殖桶顶部距水面3 m处安有摄像头（图2）。共有8个养殖桶，每个养殖桶有80尾幼鱼，这些幼鱼均经过24 h的饥饿。这8个养殖桶分别进行 40、60、80、100、120、140、160和200 dB的声压级刺激。实验开始前，噪声播放器、信号放大器和水下扬声器先在未放幼鱼的养殖桶中调试，用水听器实测声压级，调到所设定的声压级后，关闭噪声源，将水下扬声器移至所对应声压级的养殖桶。实验开始时，先用饲料将幼鱼诱集至圆心处，然后瞬间开启噪声源，观察幼鱼的游泳行为。

图2 实验装置示意图Fig.2 Diagram of experimental device

1.4 短期单次和多次噪声刺激对幼鱼部分生理指标的影响

实验装置同1.3。根据1.3所得的噪声声压级敏感范围，选取120 dB和150 dB这2个刺激声压级。实验共分4组，分别进行120 dB&1次（A组）、150 dB&1次（B组）、120 dB&3次（C组）、150 dB&3次（D组）的处理。每组3个重复，每个重复30尾鱼。每次刺激持续5 min，每次刺激间隔2 h。刺激结束后0.5 h，往养殖桶里加丁香酚麻醉幼鱼。以未刺激的幼鱼为对照组（control）。

用含肝素钠抗凝剂的5 mL注射器从麻醉的幼鱼尾部脊椎取血，5 000 r·min-1离心取血浆，置于-80℃超低温冰箱中保存，用于检测皮质醇（cortisol）、血 糖 （blood glucose）、血 红 蛋 白（hemoglobin）和乳酸（lactic acid）这 4个生理指标。检测方法为从南京建成生物工程研究所购买适合鱼类检测的试剂盒并按其说明书进行。

1.5 长期噪声刺激对幼鱼存活、生长、肠道菌落及部分免疫指标的影响

实验装置同1.3。实验分对照组和噪声组，对照组不进行刺激；而噪声组刺激声压级值为120 dB，每天早、中、晚刺激3次，每次刺激持续5 min。每组设3个重复，每个重复30尾幼鱼。对照组和噪声组每天投喂3次浮性膨化颗粒配合饲料，每次在噪声刺激前0.5 h投喂；每天及时捞出并记录死亡的幼鱼。实验共持续30 d。实验结束后清点各组存活幼鱼，并往养殖桶里加丁香酚麻醉幼鱼。

每个重复取8条幼鱼用于取血和取肠道。用含肝素钠抗凝剂的5 mL注射器从麻醉的幼鱼尾部脊椎取血，5 000 r·min-1离心取血浆，-80℃冻存用于检测免疫指标。取血后，无菌解剖幼鱼取其肠道，置于DNAse/RNAse-Free冻存管，-80℃冻存用于检测肠道菌落。每个重复剩余的幼鱼用于测量体质量，计算特定生长率（specific growth rate，SGR）。SGR=100 ×（lnWfinal-lnWinitial）/T，其中Winitial为鱼体实验前初始体质量，Wfinal为鱼体实验结束后的最终体质量，T为实验时间。

所检的免疫指标包括：免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM），干扰素-α（interferon-α，IFN-α），白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）。检测方法为从南京建成生物工程研究所购买适合鱼类检测的酶联免疫试剂盒并按其说明书进行。肠道菌落检测采用16SrDNA高通量测序分析技术，由上海欧易生物医学科技有限公司协助完成。

1.6 噪声刺激对幼鱼摄食行为的影响

实验同样在直径为6 m、深度为1 m的玻璃钢养殖桶中进行。每桶200尾幼鱼作为1个重复，共设3个重复。每桶设2个定点投喂点，即6点钟方向和12点钟方向，其中6点钟方向无噪声源；12点钟方向设有噪声刺激源，声压级为120 dB，每隔1 h刺激一次，每次刺激持续5 min。第一次刺激时间为07∶00，0.5 h后，往2个定点投喂点各一次性投放200粒颗粒饲料。之后观察各刺激时间（08∶00、09∶00、10∶00）后，幼鱼的行为、分布及投喂点的饲料剩余量。

1.7 数据分析

实验数据均用平均值 ±标准差（Mean±SD）表示。噪声组和对照组以及各个处理组之间的差异显著性用软件Origin 8.0进行单因素方差（One-way ANOVA）分析。若有显著差异，则继续进行Tukey多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 噪声声压级对幼鱼游泳行为的影响

在不同梯度噪声声压级刺激下，幼鱼的游泳行为见表1和图3。

表1 不同梯度噪声声压级刺激下幼鱼的游泳行为Tab.1 Swimming behaviors of L.crocea juveniles stressed by different levels of ship noise intensities

图3 摄像仪所观测到的幼鱼在不同梯度噪声声压级刺激下的游泳行为Fig.3 The camera-observed swimming behaviors of L.crocea juveniles under different levels of ship noise intensities

2.2 短期单次和多次噪声刺激对幼鱼部分生理指标的影响

短期内单次和多次噪声刺激下，幼鱼血浆中4个与应激相关的生理指标均表现出不同程度地上升，其中皮质醇、血糖和乳酸上升幅度尤为显著（图4）。变化趋势方面，皮质醇不同于另外3个指标，其具体表现为：单次刺激后，即达到峰值；而多次刺激后，反而较单次刺激有所下降。血糖、血红蛋白和乳酸这3个指标则呈现出相似的变化规律，均表现为多次刺激要高于单次刺激。另外，无论是单次刺激还是多次刺激，120 dB和150 dB这两个声压级强度均未表现出明显差异。

图4 短期单次和多次噪声刺激下幼鱼血浆中皮质醇、血糖、血红蛋白和乳酸含量的变化Fig.4 Changes of cortisol，glucose，hemoglobin and lactic acid in plasma of L.crocea juveniles stimulated by short-term single and multiple ship noises

2.3 长期噪声刺激对幼鱼存活、生长、肠道菌落及部分免疫指标的影响

经过30 d的噪声刺激，幼鱼的存活情况与对照组无显著差异，但生长表现则明显减缓，其SGR值仅为0.72±0.08，远低于对照组的1.23±0.16（图5）。免疫指标方面，免疫球蛋白M、干扰素-α、白介素-1β和肿瘤坏死因子-α的含量均显著低于对照组（图6）。另外，噪声刺激后，幼鱼的肠道菌群组成与对照组发生了很大的变化，其中变化之一是噪声组的肠道益生菌，如芽孢杆菌（Bacillus）、乳杆菌（Lactobacillus）等相对丰度显著降低（图7）。另外，噪声组的弧菌（Vibrio fortis）相对丰度（75.2% ±3.6%）也显著高于对照组（15.8% ±2.8%）。

2.4 噪声刺激对幼鱼摄食行为的影响

实验发现：幼鱼能准确识别噪声源的位置，刺激1次后就对噪声源具有了一定的记忆性。先吃无噪声源的投饵点饵料（6点钟方向），基本很少吃有噪声源的投饵点饵料（12点钟）。只有等到无噪声源的投饵点（6点钟）饵料量很少了，才试探性地去吃有噪声源的投饵点饵料（09∶30—09∶50）。第4次刺激（10∶00）一启动，幼鱼又趋避到6点钟方向（10∶05），但刺激一结束，幼鱼在6点钟方向逗留的时间很短，很快就游往12点钟方向进行摄食（图8）。

图5 噪声刺激30 d后大黄鱼幼鱼的存活和生长表现Fig.5 Survival and growth performance of L.crocea juveniles after 30 days of noise stimulation

图6 噪声刺激30 d后大黄鱼幼鱼血浆中免疫指标（免疫球蛋白M、干扰素-α、白介素-1β和肿瘤坏死因子-α）的变化Fig.6 Changes of immune indexes（immunoglobulin M，interferon-α，interleukin-1βand tumor necrosis factor-α）in plasma of L.crocea juveniles after 30 days of noise stimulation

图8 噪声刺激下各时段幼鱼的游泳和摄食行为示意图Fig.8 Diagram of swimming and feeding behaviors of L.crocea juveniles stimulated by noise in different periods

3 讨论

研究显示，全世界大概有800多种鱼具有发声能力。鱼类的发声行为对它们的种群沟通，如索饵、避敌、繁殖、洄游、集群等具有非常重要的作用［11］。然而，随着人类对海洋开发的深入，人类制造的水下噪声与日俱增。这些噪声严重地干扰了鱼类的发声行为，或轻或重地影响到了它们的生存和生活［12］。大黄鱼是典型的具发声能力的鱼类，对外界声响相当敏感。20世纪50—60年代中国盛行的敲罟作业和过度捕捞，正是利用了大黄鱼对水中声音较敏感这一特性，导致野生大黄鱼几乎陷入灭绝的窘境。虽然近些年休渔和人工放流等措施不断推行，以期恢复大黄鱼的渔业种质资源，但进展十分缓慢，至今仍无法形成有规模的渔汛。原因之一就可能与日益增长的水下噪声有关。大黄鱼对噪声十分敏感，水下噪声严重影响到了它们的索饵、集群和繁殖等，进而危及到了种群的繁衍。在众多水下噪声中，船舶噪声是对大黄鱼影响最常见、最直接、最频繁的噪声。

3.1 不同梯度噪声声压级对幼鱼游泳行为的影响

本文研究发现，当噪声声压级＞60 dB时，幼鱼就开始呈现出不同程度的应激和趋避行为。这一噪声敏感阈值低于多数石首鱼科鱼类的敏感阈值（90～100 dB）［8-10］，佐证了大黄鱼对声音非常敏感的事实。但在殷雷明等［8］研究中发现，大黄鱼的船舶噪声敏感阈值约为88 dB。两者研究结果的差异可能源于幼鱼的个体大小以及幼鱼所处的环境，殷雷明等［8］的实验幼鱼体长约为20 cm，大于本文的 10 cm；另外，殷雷明等［8］的实验幼鱼长期处于大水面的网箱养殖环境中，频繁的水下噪声刺激，可能增强了幼鱼对船舶噪声的耐受性。

此外，本研究也发现，随着声压级的增大，大黄鱼幼鱼的应激趋避行为越来越强烈，依次表现出：游泳速度加快，鱼与鱼之间、鱼与桶壁之间发生碰撞，瞬间反应无序，跳跃等行为；当声压级＞200 dB时，刺激2 min后就有死亡个体出现。刘贞文等［13］也报道了相似的结果：大黄鱼幼鱼（体长约10 cm，8月龄），在声波频率600 Hz、声压级130 dB刺激下，趋避行为变得迟钝和无序，还伴有跳跃行为；当声压级达到168 dB时，噪声源正上方的幼鱼直接致死。

3.2 短期单次和多次噪声刺激对幼鱼部分生理指标的影响

鱼类的应激受控于下丘脑—垂体—肾脏髓质（HPI轴）［14］。鱼类的应激首先表现为生理指标的波动，造成鱼体外与体内稳态的变化。鱼类对应激的短期生理反应可分为两个阶段：第一阶段是神经系统接受外界应激信号并迅速分泌肾上腺素，刺激鱼类头肾组织释放皮质醇，皮质醇调动体内储备的能量以提供调节渗透压所需的氧气和能量；第二阶段主要涉及生理生化方面的代谢反应，包括血浆和组织中代谢产物、血液学指标的变化以及应激蛋白/基因的激活等［15］。因此，血浆皮质醇、渗透压、乳酸、血红蛋白、血糖、血氨等指标已被作为鱼类的应激指示指标被广泛、频繁地用于评估鱼类所受的各种环境胁迫、操作胁迫和运输胁迫等［16-19］。

本文研究发现，经船舶噪声短暂的刺激后，大黄鱼幼鱼血浆中皮质醇、乳酸、血红蛋白和血糖显著升高，但120 dB和150 dB的响应幅度之间未见明显差异。此外，皮质醇单次刺激后即达到峰值，而多次刺激后反而有所下降，这一结果佐证了皮质醇为鱼类应激第一阶段中响应最灵敏的指标之一，也说明了皮质醇的响应可能不具有累加效益，多次的刺激反而可能增加耐受性［6］。但是，不同于皮质醇，另外 3个指标（血糖、血红蛋白和乳酸）的变化规律则是响应速度要滞后于皮质醇，并且多次刺激要高于单次刺激，这一结果也佐证了血糖、血红蛋白和乳酸这些指标主要在应激过程中第二阶段响应，也说明了这些指标具有累加效益，重复的刺激加剧幼鱼的生理代谢负担［15］。除了本文所述的大黄鱼外，船舶噪声对其他水生动物的生理影响也常有报道。在 鲤 （Cyprinuscarpio）［20］和 鮈 鱼 （Gobio gobio）［20］中，船舶噪声同样引起血浆皮质醇急剧升高；而在灰海马（Hippocampuserectus）［19］和金头鲷（Sparusaurata）［21］中，船舶噪声可引起皮质醇、促肾上腺皮质激素、血糖、乳酸、红细胞压积、热休克蛋白70、总蛋白、胆固醇、甘油三酯和渗透压等一系列生理指标发生剧烈波动。

3.3 长期噪声刺激对幼鱼存活、生长、肠道菌落及部分免疫指标的影响

本文研究发现，长期处于噪声刺激，大黄鱼幼鱼的生长减缓，免疫水平下降。这可能归因于应激过程是个高耗能的过程。应激状态下，鱼体内分泌大量肾上腺素和皮质醇等物质，机体合成代谢处于高强度水平，大量耗能，导致没有足够的能量用于分配生长和免疫。此外，合成分泌的肾上腺素和皮质醇本身也能对机体产生毒害作用，如影响食物摄入、消化和吸收；损伤机体部分组织器官；抑制机体免疫功能等［21-24］。所以，一是鱼体把大量的能量用于肾上腺素和皮质醇的合成代谢，导致用于生长和免疫的能量分配减少；二是过多合成的肾上腺素和皮质醇会对机体产生摄食和吸收减少、抑制免疫等不良影响，是大黄鱼幼鱼在噪声长期刺激下生长变缓、免疫低下的主要原因。类似的结果也同样出现在其他水生动物中，如海马（Hippocampuserectus）［18］，金鱼（Carassiusauratus）［25］和 虹鳟 （Oncorhynchus mykiss）［26］，噪声刺激同样使它们生长变缓，免疫下降，抗病力减退。

肠道菌群是非常重要的菌群，对维持机体的健康具有重要的作用。肠道菌群的失调容易引发机体内稳态的紊乱，进而诱发各种疾病。多种疾病目前已被研究证实是因为肠道菌群的失调所致［27-28］。关于环境胁迫对鱼体肠道菌群的影响至今未见报道。本文研究发现，在长期的噪声刺激下，大黄鱼幼鱼肠道菌群与未刺激幼鱼相比，无论是菌群组成还是相对丰度，都发生了很大的变化。其中最明显的变化之一是刺激幼鱼的肠道益生菌如芽孢杆菌、乳杆菌等明显缺失。这些益生菌已被广泛证明在维持鱼体的稳态、促进鱼体的消化、改善鱼体的免疫等方面发挥着重要的作用［29］。为此，在噪声长期刺激下，大黄鱼幼鱼生长减缓、免疫力下降的原因除了上述的两个原因外，还跟噪声刺激导致鱼类肠道益生菌失衡有着直接的关系。