基于香兰素食品添加剂的定量分析方法研究

郑学斌

(合肥职业技术学院生物工程学院,合肥 238000)

香兰素是具有广泛用途的芳香族有机化合物，又名香草醛、香兰醛，天然存在于香荚兰豆中[1-3]。香兰素是人类生活中非常重要的食用香料之一，广泛应用于食品、饮料、香料和制药等行业，它具有香荚兰豆香气及浓郁的奶香，是食品添加剂中的重要原料[4-6]。除作为食品添加剂外，它还是医药合成中的重要原料和中间体，例如甘蔗的催熟剂、杀虫药剂的除草剂、电镀液的添加剂、橡胶制品的除臭剂以及塑料制品的抗硬化剂等，其应用范围日益扩大[7-8]。

文献报道香兰素合成的方法较多，包括化学法、生物法和提取法。其中化学法主要有对甲酚法、愈创木酚法和电解氧化法等。目前工业化生产中主要采用愈创木酚法。在制备生产过程中，原料愈创木酚和副产邻位香兰素成为产品控制的重要指标，而在香兰素添加剂使用过程中，质检机构并未完善对这两种杂质的检测和控制要求。本研究将香兰素使用时所出现的所有组分同时进行分离测定，供食品检测中对香兰素相关杂质的分析提供支持[9-10]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

香兰素，国药集团化学试剂有限公司；邻香兰素，海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈，色谱级，上海星可高纯溶剂有限公司；冰乙酸，天津市大茂化学试剂厂；愈创木酚，天津市大茂化学试剂厂；等。

液相色谱仪，Agilent 1260 Infinity Ⅱ，配有 G7111A 1260 Infinity Ⅱ 四元梯度泵含在线脱气机；OPTION 001 液相工具包；G7129A 1260 Infinity II样品瓶进样器；G7114A可变波长紫外检测器；M8301AA工作站数据处理系统；M8500AA工作站采样系统；等。

1.2 标准溶液配制

系统适用性溶液：分别称取香兰素 0.80 g、愈创木酚 0.10 g、邻香兰素 0.10 g、水 9.0 g，分别置 50 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，混匀即得。

样品溶液：精密称取试样1 g，置于100 mL容量瓶中，用0.05 mol/L冰乙酸溶液∶乙腈=8∶2流动相定容后摇匀，即得。

标准溶液:配制10个不同浓度的标品混样，总质量在10 g左右，分别装入50 mL容量瓶,用流动相溶解并定容至刻度。10个标品配制浓度如表1所示。

表1 标准溶液配制表

加标回收样品配制：取三批供试品溶液，分别准确量取10 mL至25 mL容量瓶中，分别加入各混合标准溶液1.0 mL，加流动相稀释至刻度，制备加标回收率溶液， 按色谱条件检测。

混合标准溶液1：称取香兰素0.249 4 g、邻香兰素0.015 6 g、愈创木酚0.024 5 g置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度。

混合标准溶液2：称取香兰素0.400 6 g、邻香兰素0.053 7 g、愈创木酚0.040 3 g置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度。

混合标准溶液3：称取香兰素0.300 4 g、邻香兰素0.039 4 g、愈创木酚0.049 1 g置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度。

表2 各相关峰的保留时间

图1标准样图谱

图2样品图谱

1.3 色谱条件

流动相：A—0.05 mol/L冰乙酸溶液；B—色谱乙腈；洗脱比例：流动相 A∶B=8∶2，保持35 min结束；柱温： 30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：279 nm；进样量：20 μL；色谱柱为Inertsil ODS-3柱，柱长250 mm，内径4.6 mm，膜厚5 μm。

1.4 测定

将各稀释浓度的混合标准溶液及稀释好的样品溶液于液相色谱仪规定条件下检测。以各峰的峰面积与各标准的实际含量做标准曲线，按回归方程配制含有各组分不同浓度的标准溶液,分别进样, 以各组分峰面积比Y(A)对各组分标准浓度X(Pi//mg/L)进行线性回归，回归方程为：Y=aX+b，其中Y代表i组分峰面积，X代表i组分标准溶液浓度。

2 结果与分析

2.1 定性分析

进样系统适用性溶液测得各组分的保留时间见表2，色谱图见图1和图2。在相同的色谱条件下，试样溶液中各组分色谱峰与实验中相对应的色谱峰保留时间和峰型相似，且保留时间的相对误差在1.0%范围内，因此认定为同一相关峰。

从图1和图2可以看出，样品峰与标样峰对应性很好，也能够很好地分离，说明该液相色谱法可以对样品进行定性、定量检测。

表3 线型关系数据

2.2 定量分析

2.2.1 线性范围 依据表1配制标准溶液，根据色谱中的响应值绘制标准曲线。各组分的 a、 b值及相关系数见表3。由表3数据可以看出，各组分在进样浓度为100～8 000 ppm，其响应值峰面积比与组分浓度呈良好线性关系。

2.2.2 定量的精密度测定 配制含有各组分的标准溶液，平行测定5次，每次进样20 μL，各组分峰面积响应值见表4。

表4 精密度数据

2.2.3 定量的准确度测定 通过加标回收样品的配制进行色谱进样分析，得到结果见表5。

表5 准确度数据

从准确度和精密度的数据可以看出，各组分的回收率在91.04%～117.60%，通过数据分析，可以看出供试品溶液3中所做“本底+混标3”实验数据明显偏高， 通过t检验为异常数据，故舍去。回收率修正为93.10%～101.96%，实验方法良好，可以对香兰素、邻香兰素、愈创木酚等组分准确定量。

3 结论与讨论

此方法开发之初，曾用普通C18柱来分析样品，但做出的峰型拖尾严重，分离效果差，严重影响了分析结果的准确性。经过反复试验，最后用Inertsil ODS-3 柱后发现，峰型分离效果很好，各峰没有拖尾现象，能够准确计算样品的各组分含量，所以选用 Inertsil ODS-3柱，柱长250 mm、内径4.6 mm、膜厚5 μm为最佳色谱柱。在实验最初，用甲醇跟水的比例是 40∶60，香兰素、愈创木酚的峰型拖尾很严重，峰型很差，后又用磷酸盐调试pH值，峰型还是不理想，最后用水∶乙腈=8∶2 调试，峰型才能达到理想状态。

通过以上结果可得出结论，用本文所述的液相色谱法对香兰素添加剂进行分析,能够对香兰素制备过程的杂质进行定性和定量分析，该方法经验证线性好、重复性强、准确度高,是一种较为理想的分析方法，为香兰素添加剂食品检测方法的规范提供了有利的依据。