1例盖尔森基兴诺卡菌血流感染病原学诊断报告

孙 菱，杨建科，郭桂英，欧阳慧，王燕玲

诺卡菌是革兰阳性的长杆状、有分支的细菌，抗酸染色呈弱抗酸性，为条件致病菌。诺卡菌属种类众多，其中引起人类感染的有十余种，近年来诺卡菌属的一些新种也陆续被定义，盖尔森基兴诺卡菌(Nocardiacyriacigeorgica)是2001年在德国由Yassin等人从一个慢性支气管炎病人的支气管分泌物中发现并重新定义的[1]。诺卡菌病在国内报道中相对少见，其中盖尔森基兴诺卡菌血流感染更为罕见，其临床表现和影像学缺乏特异性，因此在临床工作中易误诊、漏诊。然而诺卡菌病的病死率高[2]，早期诊断、及时正确的治疗可提高其治愈率、改善预后[3]。故本文通过回顾分析乐山市人民医院1例盖尔森基兴诺卡菌血流感染的临床资料及文献复习，加深对诺卡菌的认识，提高其诊治水平。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1菌株来源 收集我院肾内科1例诺卡菌感染的临床分离株，质控菌为金黄色葡萄球菌 ATCC29213、大肠埃希菌 ATCC 35218。

1.1.2主要试剂 环丙沙星、阿米卡星、亚胺培南等抗菌药物标准品购自大连美仑生物技术有限公司，血琼脂培养基购自郑州安图生物公司。

1.2 方 法

1.2.1临床资料 患者，男，87岁，因“排尿困难半月，咳嗽、咳痰、言语不清4 d”于2018年1月14日入院。入院半月前患者无明显诱因出现排尿困难，于4 d前受凉后出现咳嗽、咳痰，咯白色黏液痰，随后出现言语不清，伴呃逆、双下肢无力，无意识障碍、晕厥、一过性黑朦及四肢抽搐。既往有慢支炎、肺气肿病史30年。查体：双肺呼吸音粗糙，双下肺闻及湿啰音及明显哮鸣音，伸舌稍右偏，右侧鼻厝沟稍变浅，右侧巴氏征可疑阳性。彩超提示：“前列腺测值偏大；前列腺结石。”行胸部CT、头颅CT(图1)，报告提示：“1、左侧顶叶片状稍低密度，不除外梗塞可能：双侧侧脑室旁半卵圆中心多发缺血缺氧灶，脑白质疏松，脑萎缩。慢支炎、肺气肿，双肺炎症，部分间质性改变。右肺上叶后段片结影：肿瘤？炎症？双侧胸腔积液。”血常规：WBC22.9×109/L，NEU21.18×109/L，RBC1.91×1012/L，Hb59g/l；CRP153.5 mg/L ；PCT0.495 ng/mL；血清铁蛋白>1 650 ng/mL；尿常规：红细胞27/HP，白细胞295/HP；肝功：谷丙转氨酶87 U/L，谷草转氨酶122 U/L，白蛋白29.5 g/L，直接胆红素13.7 mo1/L。入院后经验性使用哌拉西林他唑巴坦抗感染，并予以扩张支气管、祛痰、输血等治疗，但患者感染未得到控制。1月18日其血、尿、痰细菌培养结果回示临床后，改用米诺环素100 mg口服2次/d，复方磺胺甲恶唑片0.96 g口服2次/d。

图1 CT检查Fig.1 CT Examination of the patient

1.2.2病原学鉴定 检验科微生物室将该患者尿、痰标本接种于血琼脂平板，同时对标本进行了革兰氏染色，随后又行改良抗酸染色。将血培养仪提示有细菌生长的血培养瓶转接种至血琼脂平板培养，35 ℃孵育2 d，观察菌落形态，并染色镜检。

1.2.316S rRNA测序 分别从接种血、尿、痰标本的琼脂平板中挑取多个可疑菌落送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序鉴定。实验室提取细菌DNA作为模板，引物为细菌16S rRNA通用引物[4]：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT，目的片段长度约1 500 bp，反应参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃后延伸7 min。

1.2.4药敏试验 用微量肉汤稀释法测8种诺卡菌常用抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)，包括阿米卡星、头孢曲松、环丙沙星、亚胺培南、利奈唑胺、米诺环素、莫西沙星、复方磺胺甲恶唑，操作和判读标准参照美国临床和实验室标准协会(CLSI) M24-2A。设置阴、阳性对照，并按相同方法步骤进行质控菌的操作。35 ℃孵育3 d后读取结果。

2 结 果

2.1患者情况 经抗诺卡菌治疗后，于2018年1月27日复查血常规WBC 14.87×109/L， Hb 87 g/L；CRP 33.1 mg/L；PCT 0.118 ng/mL；尿常规：红细胞5/HP，白细胞5/HP，感染指标较入院时明显下降，且症状较前减轻，但1月31日患者要求自动出院，嘱其继续抗感染治疗，并定期门诊随访以指导用药，患者依从性差，未执行。

2.2细菌培养及涂片染色结果 镜检发现革兰阳性、分叉的树枝状菌体(图2，B)，检验者怀疑为诺卡菌感染，遂行改良抗酸染色(图2,C)。分别将其血、尿、痰标本的诺卡菌分离株接种于血琼脂平板分离培养，35 ℃孵育2 d，观察菌落形态见表面褶皱、干燥的圆形菌落(图2,A)，不嵌入培养基生长，挑取培养菌落进行改良抗酸染色，呈弱抗酸性(图2,D)。

2.3测序分析鉴定至种 PCR扩增得到1 500 bp 左右的产物，经BLAST比对分析PCR产物测序结果与NCBI数据库Nocardiacyriacigeorgica的16S序列(KY363801.1)相似度为99.93%，结果证实该患者血、尿、痰标本中均含有盖尔森基兴诺卡菌。

2.4药敏试验结果 结果显示此株诺卡菌对上述8种抗菌药物均敏感。

A.Colonies after incubating 48h；B. Sputum smear with Gram staining, ×1000；C. Sputum smear with Kinyoun’stain, ×1000；D.48h Colonies with Kinyoun’stain, ×1000图2 诺卡菌菌落形态及镜检结果Fig.2 Colonial morphology of Nocardia and the result of smear detection

3 讨 论

诺卡菌可引起各种临床感染，从皮肤和软组织感染到呼吸道、中枢神经等全身各个系统的感染，以肺部感染最为常见。诺卡菌呼吸道定植的重要危险因素有支气管扩张或其他结构性肺疾病[5]，易感人群为免疫功能低下或合并有慢性基础疾病的患者，如长期应用免疫抑制剂的患者，获得性免疫缺陷综合征、糖尿病、慢性阻塞性肺病等患者[6]，健康人群仍存在感染风险。诺卡菌病的肺部临床表现主要为咳嗽、发热、胸痛等非特异性感染的症状，实验室检验结果中常有中性粒细胞、CRP、血沉等感染指标升高，影像学检查亦缺乏特异性改变，可有渗出、空洞、实变、结节、胸腔积液等一种或多种表现。诺卡菌病与普通细菌、真菌感染有相似之处，且涂片呈弱抗酸性易与结核分枝杆菌相混淆，常被误诊以致延误最佳治疗时机。因此对于经验性抗一般细菌、抗真菌或抗结核治疗无效且存在以上危险因素的肺部感染患者，应考虑到此菌感染的可能。

诺卡菌繁殖速度慢，固体培养基上一般需3～5 d肉眼可见，而有些实验室培养时间不够，或留取标本前已使用抗生素，另外不合格痰标本进行细菌培养时，口腔菌群的迅速生长使诺卡菌受到抑制，均可一定程度地影响细菌培养的阳性率，造成漏检。因此对于可疑病例标本，应适当延长培养时间，并在接种培养的同时进行标本的革兰氏染色涂片镜检，当标本中有色素颗粒，取其用玻片压碎涂片，并做革兰氏染色，若发现革兰氏染色阳性分支状的长杆菌应高度警惕诺卡菌感染，继续做弱抗酸染色，结果为革兰染色及弱抗酸染色阳性时，可初步确定为诺卡菌。本例检验科微生物室对细菌培养标本进行了常规的革兰氏染色涂片镜检，减少了漏检率，使临床第4 d可以正确用药，对疾病的诊断、治疗、预后起到了非常重要的作用。Yasuo T对30份肺诺卡菌病临床病例进行了研究，革兰氏染色对诺卡菌病的早期诊断和适当治疗是最重要的一步[7]。

北京大学第一医院的黄磊等人在9年的时间里搜集了我国7个城市的53株诺卡菌进行了分析，研究表明尽管其耐药率在世界不同区域之间差异很大，磺胺类药物仍是目前治疗诺卡菌病的一线治疗药物，首选复方磺胺甲恶唑。研究结果显示，在我国，阿米卡星、亚胺培南和利奈唑胺可作为初始经验性治疗诺卡菌病的替代用药[8]。

综上，诺卡菌病的诊断主要依靠实验室检出病原菌，合格标本的采集和革兰氏染色涂片对诺卡菌病的早期诊断具有重要作用。不同种别的诺卡菌药物敏感性有较大差异，建议进行药敏试验及精确鉴定以指导正确用药，16S rRNA测序分析能快速、精确地将诺卡菌鉴定至种。本例病例中检验科微生物室对细菌培养标本常规地进行了革兰染色涂片镜检，故及时有效地检出了诺卡菌，且通过16S rRNA测序分析鉴定此例为盖尔森基兴诺卡菌感染，以期为该细菌今后的研究提供临床资料参考。

利益冲突：无

本文引用格式：孙菱,杨建科,郭桂英,等.1例盖尔森基兴诺卡菌血流感染病原学诊断报告[J].中国人兽共患病学报,2020,36(1):80-83. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.166