疫苗候选抗原Pvs48/45在中缅边境的遗传多样性特点

魏海潮，王 琳，赵 艳，张学星，胡钰冰，张杨明慧，王庆辉，曹雅明

疟疾是由疟原虫引起的一种严重的寄生虫病，由感染的按蚊叮咬传播[1]。至今，全球仍有2.19亿疟疾病例发生[2]。其中间日疟原虫(Plasmodiumvivax，P.vivax)是分布最为广泛的疟原虫，尤其在东南亚地区普遍流行[3]。东南亚地区的疟疾传播主要集中在国际边界，中缅边境地区就是受威胁地区之一[4]，该地区是我国输入性疟疾的主要来源，对于我国疟疾消除计划的实施是一项复杂而严峻的挑战[5]。近几年，疟原虫的耐药性和血液期疫苗候选抗原变异的问题使得制备新药和开发有效的传播阻断疫苗(Transmission-blocking vaccines, TBVs)变得十分迫切。TBVs靶向疟原虫的有性阶段[6]，如配子体阶段，按蚊只有从受感染的宿主血液中摄取配子体才能导致疟疾传播[7]。P.vivax较早产生配子体，在感染者出现疟疾症状之前即有传播能力，更适合通过开发TBVs来阻断其传播。

Pvs48/45是间日疟原虫雌雄配子体表面蛋白，对雄配子受精发挥十分关键的作用。Pvs48/45属于六-半胱氨酸(6-Cys)蛋白家族，由3个同名半胱氨酸富集结构域(cysteine-rich domains, CRDs)组成：CRDI区(aa:26-194)，CRDⅡ区(aa:195-296)和CRDⅢ区(aa:297-415)[8]。早期对Pfs48/45的研究表明其单克隆抗体有效的阻断了恶性疟原虫向按蚊的传播[9]；膜喂养实验表明，抗Pvs48/45小鼠血清显著减少了在蚊子中肠发育的间日疟原虫卵囊的数量[8]；近期在大肠杆菌中构建的重组Pvs48/45在小鼠和猴子体内具有良好的免疫原性和传播阻断活性[10]。这些研究表明Pvs48/45是一种有前途的TBVs候选抗原。

基因的多态性是评估抗原能否作为疫苗研制靶点的关键。同一基因在不同地区的遗传多样性成为疫苗广泛应用的障碍。因此，对不同地区Pvs48/45多态性的分析，可显著提升疫苗的研究进程。中缅边境地区作为我国输入性疟疾的主要来源，尚未进行过Pvs48/45多态性的研究。本研究通过评估中缅边境地区Pvs48/45开放阅读区(open reading frame, ORF)和CRDs的遗传特点，为Pvs48/45作为中缅边境地区TBVs候选抗原提供有力的证据。

1 材料与方法

1.1研究地点和样本采集 经中国医科大学伦理委员会批准，获得了所有参与者或其监护人知情同意后，本研究在中缅边境的Laiza镇疟疾诊所收集了当地以及周边村落病人的指尖血，并制备滤纸血样本。经专业人士通过血涂片镜检和巢式PCR，确认单纯间日疟原虫感染样本39例，用于Pvs48/45基因多态性分析。

1.2Pvs48/45基因组DNA提取，扩增和测序 根据试剂盒说明书，使用TIANamp Blood Spots DNA Kit试剂(DP318-03,TIANGEN,中国)提取基因组DNA，巢式PCR扩增Pvs48/45的ORF(碱基位点：1-1353 bp；氨基酸位点1-450 aa)，特异性引物如下，First-PCR-F：5′-TCCTCTACACCGCTCTACCG-3′，First-PCR-R：5′-GTGAACCGCATAACTT-TCCC-3′；Nest-PCR-F：5′-GTTTAAACTTAAG-CTTATGTTGAAGCGCCAGCTCGC-3′；Nest-PCR-R：5′-GCCCTCTAGACTCGAGTCAGAAGTACAACAG GAGGAG-3′ 。使用具有强3′-5′校正活性的KOD plus DNA聚合酶(Toyobo，日本)进行扩增。First PCR和 Nest PCR分别在10 μL和30 μL的反应体系中进行。反应体系包含10×KOD-Plus-Neo buffer，2 mmol/L dNTPs，25 mmol/L MgSO4，100 μmol/L of each primer，0.6 units of KOD-Plus-Neo DNA polymerase，以及1 μL gDNA模板。First PCR的扩增条件为98 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,68 ℃ 1 min(30个循环)，68 ℃ 5 min；Nest PCR将退火温度调至62 ℃，循环数提高至35次。采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测产物；特异性扩增产物送华大基因测序，测序引物为Pvs48/45 seqF: 5′-GAACCATATTCTTACCTA-CC-3′，Pvs48/45 seqR: 5′-AGGAGCATTCTGCGGTCACG-3′。

1.3Pvs48/45基因序列组装和多态性分析 测序获得的DNA序列通过MEGA 4.0手动编辑组装，并使用Clus-talW与Sal-I参考株(PlasmoDB: PVX_083235)进行比对。使用DnaSP v5.10估计分离位点数目(The number of segregating sites，S)，单倍型(The number of haplotypes，H)，单倍型多样性(Haplotype diversity，Hd)及其标准差(Standard deviation，SD)，以及核苷酸多样性(Nucleotide diversity，π)[11]。

1.4中性检验 为评估Pvs48/45基因的自然选择模式，通过DnaSP v5.10分别从种内和种间进行中性检验。使用Tajima’D 检验[12]，Fu and Li’s F*检验和 Fu and Li’s D*检验[13]进行种内评估。在中性选择模式下，这些检验的期望值为零；正值提示人口瓶颈或平衡选择；负值则提示人口扩增或方向选择。以夏氏疟原虫(PCYB_121700)作为外群，通过McDonald-Kreitman(MK)检验评估Pvs48/45在种间的选择模式[14]。MK检验将种内非同义突变与同义突变的比率(Pn/Ps)与种间固定的非同义突变与同义突变的比率(Dn/Ds)进行比较[15]，Pn/Ps>Dn/Ds表示阳性选择。利用Fisher’ exact test 对数据进行统计学分析，P<0.05为有统计学意义。

1.5种群分化 使用来自本研究的39例Pvs48/45序列以及从GenBank获得的27例序列进行种群进化分析，这些序列来自泰国(n=12)、瓦努阿图(n=9)和哥伦比亚(n=6)[7-8，15]。采用DnaSP v5.10估计Wright固定指数(FST)，以评估Pvs48/45在中缅边境地区与其他间日疟原虫流行区的遗传分化情况。FST解释为低分化(>0)，中等分化(>0.05)和高分化(0.15-0.25)[15]。

1.6全球单倍型网络分析 为了更直观的比较Pvs48/45基因在中缅边境地区的单倍型与其他地区的差异和系谱关系，采用NETWORK 4.6的中位数连接法构建基于Pvs48/45序列的单倍型网络图。

2 结 果

2.1Pvs48/45基因的遗传多样性 与参考序列相比，我们在中缅边境地区Pvs48/45序列中仅发现了6个突变位点，均为非同义突变(E35K，H211N，K250N，D335Y，A376T，K418R)(图1A)。其中E35K 位于CRDI区；H211N，K250N位于CRDⅡ区；D335Y，A376T位于CRDⅢ区。H211N、K250N、K418R为固定突变(100%)，D335Y，A376T突变率分别大于60%和80%。基于突变位点，将Pvs48/45序列分为5个单倍型(图1B)，频率最高的是ENNYTR(56.41%)。有限的突变导致了Pvs48/45的核苷酸多样性极低(π=0.00064)，CRDⅢ区表现出相对较高的多态性(π=0.00163),而CRDⅡ区完全保守(π= 0)(表1)。

2.2Pvs48/45基因的中性检验 种内和种间中性检验的结果一致(表2)。Tajima’D 检验、Fu and Li’s F* 检验和 Fu and Li’s D* 检验结果均大于零，在Pvs48/45基因开放阅读区分别为0.435、0.919、0.901；在CRDI区分别为0.187，0.567，0.530，在CRDⅢ区分别为0.442，0.774，0.785。MK检验结果显示Pn/Ps均大于Dn/Ds,P值在ORF区为0.029；在 CRDⅠ和CRDⅢ区分别为0.190和0.103。

图1 中缅边境地区Pvs48/45序列突变位点及单倍型Fig.1 Mutations and haplotypes of Pvs48/45 sequences in the China-Myanmar border

表1 中缅边境地区39例间日疟原虫分离株Pvs48/45基因多态性分析
Tab.1 Polymorphism ofPvs48/45 gene in the China-Myanmar border

NSiteSHHd(SD)πORF391-1326350.633(0.069)0.00064CRDI3976-582120.267(0.081)0.00053CRDⅡ39583-888010.000(0.000)0.00000CRDⅢ39889-1245230.474(0.076)0.00163

N为基因序列数量； Site 为基因位点； S为分离位点； H为单倍型； Hd(SD)为单倍型多样性(标准差)；π为核苷酸多样性； ORF为开放阅读区； CRD为半胱氨酸重复结构域.

2.3种群分化Pvs48/45基因在中缅边境地区与泰国几乎没有分化(FST=0.03)；而与哥伦比亚和瓦努阿图种群之间呈高遗传分化(FST>0. 50)(表3)。

2.4单倍型网络分析 单倍型网络图显示，在东南亚、美洲和大洋洲样本中共有15种单倍型(图2)，形成3个明显的地理集群。中缅边境地区有5种单倍型(H2、H3、H4、H5、H6)，其中H6为其特异的单倍型；H2为中缅边境地区频率最高的单倍型。中缅边境与泰国地区具有较多相同单倍型，与美洲地区没有相同单倍型，而与大洋洲只有一个相同的单倍型：H2。

表2 中缅边境地区间日疟原虫分离株Pvs48/45中性检验分析
Tab.2 Neutrality tests ofPvs48/45 in the China-Myanmar border

NTajima’DFu&Li’sPvPv/PcD*F*PsPnDsDnPORF390.4350.9190.90103123530.029①CRDI390.1870.5670.5300147100.190CRDⅡ39NANANA002721NACRDⅢ390.4420.7740.7850237160.103

Ps为种内同义突变； Pn为种内非同义突变； Ds为种间同义突变； Dn为种间非同义突变; ①P<0.05

表3 中缅边境地区与不同流行区间日疟原虫种群Pvs48/45基因的遗传分化程度(FST)
Tab.3 Genetic differentiation (FST) ofPvs48/45 gene in the China-Myanmar border and otherPlasmodiumvivaxepidemic regions

中缅边境泰国哥伦比亚瓦努阿图中缅边境----泰国0.03---哥伦比亚0.710.56--瓦努阿图0.570.450.80-

图2 间日疟原虫流行区Pvs48/45基因的单倍型网络图Fig.2 Haplotype network map of Pvs48/45 gene

3 讨 论

疟疾疫苗是阻断疟原虫传播的重要手段之一。理想的疟疾疫苗主要靶向能够诱导强免疫应答的保守靶位。与红前期和红内期疫苗相比，TBVs因具有较低的基因多态性而受到研究者的关注。配子体膜蛋白Pvs48/45是极具应用前景的TBVs候选抗原之一。本研究分析了中缅边境地区Pvs48/45基因的遗传特点，并与已报道的全球不同区域的间日疟原虫株进行种群分析，评估Pvs48/45的遗传分化特点，为以Pvs48/45为靶点的TBVs的研发提供理论基础。

与以往报道一致，Pvs48/45非常保守。我们在中缅边境地区Pvs48/45 ORF中发现了6个非同义突变位点。其中 H211N ，K250N为全球性突变位点，且在目前报道的研究中均为固定突变，提示这两种突变可能不会影响Pvs48/45在雄配子受精中的作用。在本研究中，H211N ，K250N是CRDⅡ区仅有的突变，所以在多态性研究中被识别为未突变位点，而导致无核苷酸多态性(π=0)以及无相应的中性检验值。在中缅边境地区发现的突变位点均是已报道过的突变类型，表明Pvs48/45在中缅边境地区的高度保守性。有限的核苷酸多态性(π=0.00064)也说明Pvs48/45进化保守，这远低于以往报道的Pvs48/45全球多态性(π=0.00173)[16]。在3个CRD区，CRDⅢ区的核苷酸多态性最高(π=0.00163)，CRDⅡ区最低(π= 0)。且CRDⅢ区的单倍型多样性(Hd)也明显高于其他两个区(Hd=0.474)。总之，Pvs48/45核苷酸多态性在中缅边境地区非常低， CRDⅢ区为基因中多态性相对较高的区域。

在种内中性检验结果中，Pvs48/45基因全长以及CRD I区和CRDⅢ的检验结果均大于零；在种间检验结果中，这些基因片段的Pn/Ps 均大于 Dn/Ds，且在全长基因中具有显著的统计学意义。这些结果均表明Pvs48/45基因处于平衡选择，以维持基因在群体中的有限多态性。

种群分化结果显示Pvs48/45在中缅边境地区与东南亚国家(泰国)分化程度很低(FST=0.03)，这可能是由于地理上的接近；而与美洲地区(哥伦比亚)和大洋洲地区(瓦努阿图)之间有着极高的分化水平，尤其与哥伦比亚地区FST大于0.7。由此表明疟原虫传播具有地域局限性。3个明显的地理集群也说明了这一点，在H1-H11中，除H1为美洲单倍型，其他均为东南亚特异性单倍型；H12和H13为大洋洲特异性单倍型；H14-H15为美洲特异性单倍型。中缅边境地区有五种单倍型(H2、H3、H4、H5、H6)，其中H6为其特异的单倍型，但其所占频率很低；H2为中缅边境地区频率最高的单倍型，且该单倍型在泰国也存在，因此，在东南亚流行区以H2为基础的Pvs48/45疫苗有望成为有效的疟疾传播阻断疫苗。

4 展 望

Pvs48/45基因在中缅边境地区具有低水平的多态性，是一个正在经历平衡选择的基因。CRDⅢ区为保守基因中的高多态区，因此可能为疫苗研制的重要靶点。Pvs48/45在全球具有较强的地理分化，进一步提示根据流行区的基因多态性特点开发高效疫苗的重要性。本研究为中缅边境地区间日疟原虫传播阻断疫苗的研究和应用提供理论参考。

利益冲突：无

引用本文格式：魏海潮，王琳，赵艳，等. 疫苗候选抗原Pvs48/45在中缅边境的遗传多样性特点[J].中国人兽共患病学报，2020，36(1):07-11. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.187