基孔肯雅病毒实验诊断进展

徐佩佩，丁细霞

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)为单股正链RNA病毒，包含2个开放阅读框，分别编码4种非结构蛋白(nsP1-4)和5种结构蛋白(C、E3、E2、6K、E1蛋白),根据E1氨基酸同源性被分为ECSA、亚洲、西非3种基因型[1]。CHIKV于1953年首次分离于坦桑尼亚，随后在非洲、亚洲、欧洲散发，2005年留尼汪岛的暴发波及138万人，出现严重脑炎、出血热而导致死亡率急剧上升，截止2013年基孔肯雅热(Chikungunya fever,CHIKF)已播散至美洲。患者起病初期主要表现为发热、头痛、肌痛、关节痛、皮疹、乏力等非特异性临床症状，与登革病毒(dengue virus, DENV)、寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)、黄热病毒(yellow fever virus, YFV)、西尼罗病毒(west nile virus, WNV)感染早期症状相似，均以蚊子为传播媒介，存在混合感染。且这几种病毒感染的治疗方法不同，尤其是对CHIKF有效的非甾体类抗炎药被严禁于DENV感染，而高水平的炎症细胞因子使15%～30%的CHIKF患者最终发展成关节畸形甚至死亡[2]。2009年WHO公布的东南亚CHIKV防控指南提出：诊断CHIKF至少具备以下一项：病毒分离阳性、CHIKV IgM抗体阳性、间隔至少3周的CHIKV IgG抗体滴度4倍升高和RT-PCR阳性，可通过噬斑减少中和试验或血细胞凝集抑制试验排除阿尼昂-尼昂病毒(O’nyong-nyong Virus，ONNV)或森林脑炎病毒等其他甲病毒或黄病毒感染[3]。2019年泛美抗风湿联盟联合加勒比与安第斯风湿病学会规定确诊CHIKF的ELISA或RT-PCR试验敏感性需高于74.2%且特异性高于88.4%[2]。本文将从病毒分离、血清学抗体检测、抗原检测、分子生物学检测4个方面介绍CHIKF的实验室诊断进展(表1)。

表1 基孔肯雅热诊断方法及其特征
Tab.1 Characteristics of diagnosis method for CHIKF

检测方法标本类型最佳检测时限优点缺点参考文献病毒分离血浆、血清,全血或组织发病3 d内诊断金标准;可对病毒株进行溯源需在BSL-3实验室中进行;对实验技术及设备要求高;无法早期诊断;敏感性低[4]抗体检测血清或血浆IgM:发病第4 d到第2个月;IgG:发病第7 d到半年操作简单、快速;成本低;无需特殊设备,适合大规模筛查与其他甲病毒、黄病毒属存在交叉;IgM检测不能区分急性感染与近期感染;无法早期诊断[4][5]抗原检测血清或血浆发病10 d内早期诊断方法;操作简单、快速;成本低;适合大规模筛查仅适于早期检测[6]分子生物学检测血清、血浆或全血发病第1 d到第8 d早期诊断方法;可用于基因分型设备及价格昂贵;不适合大规模筛查;仅适于早期检测[4]

1 病毒分离

病毒分离，是一种传统的检测技术，仍是目前诊断CHIKF的“金标准”。主要通过将病毒血症患者的血液或感染组织接种于小鼠脑内或接种于伊蚊细胞系(如C6/36、Aag-2)和其他病变效应明显的哺乳动物细胞系(如BHK-21，HeLa和Vero细胞)进行分离[3]。不同基因型病毒对各种细胞敏感性存在差异，其中C6/36和BHK-21细胞较适合印度洋谱系CHIKV的分离；Aag-2、HeLa和Vero细胞较适合亚洲基因型CHIKV的分离[7]。尽管病毒分离的特异性高，同时可对所分离病毒株的来源及特征进行鉴定，但其灵敏度低，对实验技术、条件要求高，需要在生物安全3级实验室进行，且病毒分离时间长，不适合于CHIKF的快速早期诊断及基层单位的推广应用。

2 血清学抗体检测

目前用于检测CHIKV的抗体方法, 主要包括免疫印迹、间接免疫荧光法、ELISA、血凝抑制试验(HI)、中和试验及胶体金免疫层析法。其中,包被抗原的间接ELISA法与检测IgM 和(或)IgG 的ELISA 捕捉法是检测CHIKV最常用的抗体检测方法。

2.1免疫印迹法 2016年，Yang等[8]以重组E2为检测抗原开发了用于检测CHIKV IgG的免疫印迹检测试剂,其灵敏度为83.3%，特异性为96.7%。同年，Verma等[9]将重组E2应用于免疫印迹以检测10对血清样本中的CHIKV IgM和IgG，准确率达100%。但由于该方法的操作繁琐，而很少应用于临床诊断。2019年泛美抗风湿联盟联合加勒比与安第斯风湿病学会发布的共识也未将免疫印迹法纳入CHIKV的诊断标准[2]。

2.2间接免疫荧光法 间接免疫荧光法的应用要求具备专业技术人员及相关设备。目前，欧盟已开发出诊断CHIKF的间接免疫荧光商品化试剂盒，该试剂盒在临床应用中也存在很多问题，部分样本结果判定困难，主观意识较强，需要重复检测样品较多。但目前美国疾控中心和加勒比公共卫生署对该试剂盒检测的准确性评估分别为96%和97%[10]。

2.3ELISA法 ELISA是目前最常用于传染性病原的抗原、抗体检测方法，该方法具有良好的特异性和敏感性，操作简单，适合于大规模筛查。近年来针对CHIKV抗体检测的间接ELISA法主要以E2蛋白为靶标抗原，但因E2蛋白存在较多的半胱氨酸残基导致蛋白可溶性差，一般以基因重组的E2蛋白[9,11-12]较常用于抗体检测。其中，Fumagalli等[12]以重组E2开发的间接ELISA与Mayaro病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、Mucambo病毒和Aura病毒均无交叉反应，可用于Mayaro病毒与CHIKV共同流行区(如巴西等)作为鉴别诊断。美国疾控中心曾对2015年6月之前开发的6种CHIKV IgM捕获ELISA商品化试剂盒进行评估，发现欧盟和Inbios生产的试剂盒诊断准确率分别为99%和100%，优化后的Abcam试剂盒与疾控中心的诊断结果一致性高达99%，而另外3种试剂盒的敏感性均低于50%[13]。目前，也有报道应用抗C蛋白单抗、E1单抗和E2单抗建立CHIKV IgM和(或)IgG捕获ELISA法。其中，Damle等[14]首次应用抗C蛋白IgG开发捕获ELISA以诊断CHIKF，与辛德毕斯病毒无交叉反应；Galo等[15]开发的IgM捕获ELISA和竞争法ELISA均与DENV无交叉反应。为了进一步降低成本与加速检测，Theillet等[16]把CHIKV IgM捕获ELISA法的原理应用于由自黏塑料与玻璃纤维纸组成的纸基分析装置，上样8～10 min后，检测结果可由手机读出，与ONNV无交叉反应，但与DENV和ZIKV存在交叉反应。为避免不同操作者采用手机读取结果引起的偏差，Wang等[17]采用自制阅读器开发了可同时诊断CHIKV和DENV IgM及IgG的侧向层析试验，诊断性能较市售快速诊断试剂盒高。

3 抗原检测方法

目前尚未有商品化的CHIKV抗原检测试剂盒，但关于CHIKV的抗原诊断方法的研究报道不少。由于E1为CHIKV相对保守的结构蛋白，因此，检测患者血清中E1抗原成为CHIKV抗原检测试剂研究的靶标。2015年，Okabayashi等[18]用E1单抗开发了诊断CHIKF的胶体金免疫层析法，敏感性为89.4%，特异性为94.4%，但待检样本中亚洲基因型较少。2018年，Huits等[19]增加亚洲基因型样本，并使用同对单抗进行免疫层析试验，发现这对单抗对亚洲基因型CHIKV的检测敏感性只有33.3%。为进一步了解该方法对不同基因型检测的差异性，Tuekprakhon等[20]对3种基因型CHIKV的E1氨基酸序列比对，发现配对单抗来源的ECSA型CHIKV在350位点处为谷氨酸，而亚洲型和西非型为天冬氨酸。并通过定点突变证实了该表位的突变是导致单抗结合能力下降的主要原因。为进一步提高检测方法的敏感性及对不同基因型的检测差异性，Tuekprakhon等[21]重新以ECSA型和亚洲型CHIKV免疫小鼠制备获得一批能够同时检测到3个基因型的CHIKV特异性单抗，且其中两株抗E1单抗与DENV、ZIKV、辛德毕斯病毒、ONNV、罗斯河病毒、Mayaro病毒、西部、东部及委内瑞拉马脑炎病毒均无交叉反应，有望发展出一种特异性的CHIKV抗原检测试剂盒。

4 分子生物学检测

4.1RT-PCR 近年来, 随着分子生物学诊断方法的日益完善,各种RT-PCR方案已尝试于病毒感染早期、抗体尚未出现时的检测，其一般针对非结构蛋白nsP1基因[22-23]及包膜糖蛋白基因[24-25]。CHIKV的RT-PCR通常应用于发病2～6 d的血浆或血清标本。最近发现全血也可作为标本检测，且诊断性能与商品化检测试剂盒基本一致[26]；对于发病1周内难以采集血液标本的患者，可以唾液标本代替检测[27]；对于哺乳期患者，母乳标本的检测时限可延长至发病第23 d[28]；精液和尿液检测时限还可延长至发病第30 d[29]。针对CHIKF与其他虫媒病毒病共同流行的特点，Cecilia等[30]开发了可用于同时诊断CHIKV和DENV的多重实时RT-PCR，Liu等[22]和Calvo等[24]分别开发了可用于同时诊断CHIKV和ZIKV感染的一步法多重实时定量RT-PCR及同时诊断CHIKV、ZIKV与DENV的一步法多重RT-PCR。Giry等[25]针对DENV、钩体病等在留尼汪岛的交叉流行特点，开发了能同时区分CHIKV、DENV和钩端螺旋体感染的一步法多重实时RT-PCR。最近，Wu等[31]开发了可用于同时诊断CHIKV、DENV、ZIKV和YFV的单管四重实时RT-PCR，该方法对CHIKV的检测下限为11拷贝/反应，与乙脑、乙肝、丙肝、肠道病毒71型、巨细胞病毒均无交叉，且与商品化试剂检测结果相一致。Boga等[32]还开发了可用于同时诊断CHIKV、DENV、ZIKV、YFV和WNV的多重实时RT-PCR，该检测体系的准确率为94.4%，与蜱传脑炎病毒和日本脑炎病毒均无交叉，这些多重RT-PCR试剂可用于疫区旅行者的感染筛查及常见虫媒病毒的流行病学监测。

4.2RT-LAMP 这是一种逆转录环介导的等温扩增技术，无需特殊仪器设备，只需水浴锅或金属浴，适合于基层医疗单位及出入境口岸等机构使用。然而，早期的RT-LAMP试剂是2007年到2012年开发的，引物设计所能利用的信息有限。2018年，Lopez-Jimena等[33]利用NCBI数据库中的110条CHIKV序列，通过LAVA软件重新设计了靶向保守区域6K-E1的引物，开发了单管一步法实时RT-LAMP，力求涵盖所有可能流行的CHIKV毒株，该法阳性预测值为97%，阴性预测值为100%，在标本储存条件不佳的情况下仍表现出较好的诊断性能。

4.3宏基因组测序 宏基因组测序是目前唯一能识别临床样品中所有潜在病原体的序列信息的诊断方法。2015年，Greninger等[34]首次将宏基因组纳米孔测序与实时生物信息学分析应用于CHIKF诊断，6 h内即可完成检测，但平均纳米孔读取错误率高达20.6%，与样本间交叉污染有关。2016年，Sardi等[35]将宏基因组测序应用于诊断CHIKV与ZIKV的共同感染。2018年，Kafetzopoulou等[36]成功将宏基因组测序应用于CHIKV与DENV共同感染的鉴定。进一步缩短文库构建时间、降低检测阈值、优化生物信息学工具、控制交叉污染与降低成本之后，有望将宏基因组测序应用于基层医疗点的急性发热性疾病的鉴别诊断与共同感染的鉴定。

综上所述，鉴于CHIKV与其他虫媒病毒感染存在相似的临床症状，不同病毒感染的临床治疗方式存在差异。因此，方便、快捷的CHIKV实验室诊断方法将有利于CHIKF的临床诊治。由于流行疫区往往存在几种虫媒病毒交替流行的特点，患者也可出现几种病毒同时感染的可能。因此，近3年CHIKV在实验室诊断方面主要致力于：制备特异性单克隆抗体建立ELISA法检测IgM 和(或)IgG、针对保守区域开发敏感性高且涵盖3种基因型CHIKV的抗原检测试剂、开发可用于同时诊断CHIKV与其他虫媒病毒感染的多重RT-PCR方法，以及简化诊断方法与降低成本以促进CHIKV诊断试剂在基层的推广。尽管目前针对CHIKV开发的实验室诊断方法已经不少，但真正获得生产许可的商品化诊断试剂为数不多，相对于昂贵的核酸检测试剂，基于ELISA和胶体金免疫层析的IgM/IgG抗体和抗原检测方法将是更好的选择。

利益冲突：无

引用本文格式：徐佩佩，丁细霞.基孔肯雅病毒实验诊断进展[J].中国人兽共患病学报，2020，36(1):60-64. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.188