马尔尼菲篮状菌致病机制相关分子研究进展

肖艳萍，钟桥石，胡龙华

马尔尼菲篮状菌是一种重要的条件致病菌，其感染具有一定的地区分布特点，主要见于东南亚、中国、印度等地区[1]。以前多见于HIV感染患者，在有效的抗逆转录病毒的作用下，HIV患者感染马尔尼菲篮状菌的比例在逐渐减少，而随着器官移植、造血干细胞移植、免疫抑制剂、新型靶向治疗药物如抗CD20单克隆抗体使用的增多，非HIV感染患者的病例在逐渐增加[2]。马尔尼菲篮状菌感染患者如未能及时接受抗真菌治疗往往预后不良，甚至死亡[3]。本文就目前马尔尼菲篮状菌相关致病机制及调控基因的研究进展进行综述。

1 马尔尼菲篮状菌的双相性转变及相关信号通路传导

马尔尼菲篮状菌是一种双相真菌，其表现出温度依赖双相性生长——25 ℃时的菌丝相和37℃时的酵母菌相。目前，研究认为双相性的转变是菌体逃避宿主免疫反应的一种应答机制。当马尔尼菲篮状菌暴露于25 ℃的外界环境中时，霉菌菌丝分化可产生无性孢子(分生孢子)，分生孢子被吸入患者肺内后可被宿主先天免疫细胞识别，继而引起宿主对外来物质的杀伤作用。对于普遍的真菌病原体来说，当真菌进入宿主肺内，真菌细胞壁上含有一种特殊成分称为病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，其可被先天性免疫细胞(如巨噬细胞)膜上的膜相关模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)识别并驱动下游细胞内信号通路，引起多种细胞免疫反应，如吞噬作用、细胞因子的产生、炎性物质的激活、活性氧的产生来破坏真菌细胞[4]。而对马尔尼菲篮状菌来说，它可在吞噬细胞内的存活并有效隔绝宿主其他免疫成分从而有效逃避宿主的防御反应。在这个过程中，马尔尼菲篮状菌双相性的转变——从多细胞的菌丝形态转变成单细胞的酵母形态，是保护其在吞噬细胞内存活的重要机制。它可有效避免在被吞噬细胞吞噬后因菌丝生长时间过长而导致细胞破裂，继而暴露于宿主的免疫系统中[6]。此外，还有研究发现，双相性真菌的酵母相和菌丝相细胞壁PAMPs成分存在差异，可引起不同的炎症反应[4]。酵母相真菌常常缺失了部分菌丝相细胞壁PAMPs，这帮助了酵母相细胞在吞噬细胞的存活[4]。而在这些过程中，马尔尼菲篮状菌具有的复杂的信号传导机制以及抗吞噬细胞杀伤作用是保证其在吞噬细胞的存活的关键。其中这些信号通路包括双组分系统、异三聚体蛋白系统(G蛋白系统)、Ras信号系统以及下游丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号级联系统(见图1)，但这些信号通路调控马尔尼菲篮状菌在吞噬细胞的存活的机制目前尚不清楚。

双组分信号传导系统是HHK接受环境刺激后产生磷酸化，然后将磷酸基团传递给RR，RR可激活MAPK通路进而调节马尔尼菲篮状菌双相性的转变；G蛋白系统是当接受外来刺激后，G蛋白中的α亚基发生磷酸化Gα-GTP复合物，G蛋白解离成Gα-GTP及Gβγ亚单位，Gα-GTP可通过激活PKA通路调节马尔尼菲篮状菌形态的转变；Ras、Rho GTP酶及其信号通路是马尔尼菲篮状菌中的Ras GTP酶RasA可以激活Rho GTP酶CflA，随后通过cAMP/PKA通路调节细胞的极化生长及细胞分裂。图1 马尔尼菲篮状菌双相性转变相关信号通路[1,5]Fig.1 Signalling pathways controlling dimorphic switch of Talaromyces marneffei

1.1双组分信号传导系统 双组分信号系统在马尔尼菲篮状菌双相性转变中发挥重要作用，当外界环境发生改变时，马尔尼菲篮状菌产生不同的信号导致形态的转变以适应环境变化。在细菌中，主要存在组氨酸蛋白激酶(histidine kinase, HK)接受外周环境变化及响应调节蛋白(response regulator, RR)。HK通过感知环境变化并发生磷酸化，将磷酸化信号传递给RR受体，继而直接调节基因表达或激活MAPK通路。而在真菌中，HK和RR融合成为杂合HK (hybrid histidine kinase, HHK)，并且通过磷酸转移蛋白(phosphotransfer protein, HPt)和第二RR发生磷酸化，从而介导基因表达或激活信号通路。在酿酒酵母菌中，分别存在由SLN1和YPD1编码的HHK和HPt，以及由SSK1和SKN7编码的第二RR，构成Sln1-Ypd1-Skn7系统，其可分别因氧化应激及渗透压的改变而激活，继而启动MAPK通路。而在其它真菌中，具有多种HHKs(包括11类)来感受不同环境的变化[5]。在马尔尼菲篮状菌中，目前已发现存在两类HHKs，即DrkA及SlnA，两者的缺失都会导致对渗透压的敏感性增加，并通过调节SakA磷酸化水平来调节HOG-MAPK通路[6]。研究表明，drkA的缺失会使细胞壁中的几丁质分布异常并增加对细胞壁结合剂的敏感性，破坏细胞壁的完整性，同时drkA基因可明显促进无性繁殖及酵母细胞的生长[7]。而slnA的突变可抑制吞噬细胞内的分生孢子的萌芽，从而影响分生孢子向酵母细胞的转变[6]。此外，sakA突变体使分生孢子不能转变为酵母相形态，提示sakA也参与了37 ℃酵母相的转变[8]。这些因素都有可能对马尔尼菲篮状菌的致病潜能造成重要影响。

1.2G蛋白系统 在马尔尼菲篮状菌中，分生孢子是感染的繁殖体，随着温度的改变，分生孢子萌发产生不同的形态。分生孢子在转变成酵母细胞的过程中，分生孢子通过极性生长形成关节孢子，并逐渐延伸，最后裂变成酵母细胞[9]。因此，分生孢子的极化萌发是决定其致病性的关键因素。研究表明，G蛋白系统在众多真菌分生孢子的形成、形态的改变及对氧化应激的适应等方面发挥重要作用。当接受外来刺激时，G蛋白α亚基发生磷酸化形成Gα-GTP复合物，导致G蛋白三聚体结构解离为Gα-GTP及Gβγ2个亚单位，它们分别激活不同的效应蛋白，引起真菌对外界环境的适应性改变。Zuber等[10]发现马尔尼菲菌中GasA(编码G蛋白α亚基)的缺失会产生厚的气生菌丝及真菌分生孢子的减少，对真菌的无性发育产生负性影响。同时，Zuber等[11]还发现另一种编码G蛋白α亚基的GasC基因具有类似GasA基因作用，负性调节马尔尼菲篮状菌的无性发育，GasC的缺失还会影响马尔尼菲篮状菌的出芽速度。

1.3Ras、Rho GTP酶及其信号通路 细胞的极化在马尔尼菲篮状菌形态转变过程中发挥了重要作用。而其中肌动蛋白在细胞骨架的构建及细胞极化中极为关键。Ras和Rho GTPases是肌动蛋白构建细胞骨架中的关键调节因子[1]。马尔尼菲篮状菌Ras和Rho GTPases家族中的ClfA、RasA在37 ℃酵母细胞的形态改变以及25 ℃时菌丝形态的形成中发挥重要作用[1]，而ClfB则影响该菌无性期发育和菌丝相生长，但不影响酵母细胞生长[12]。

2 在吞噬细胞内的存活及免疫逃避机制

马尔尼菲篮状菌侵入人体的第一步是通过吸入环境中的分生孢子进入肺部，并通过纤维连接蛋白、层粘连蛋白、硫酸软骨素、肝素和高度硫酸化的壳聚糖[13]等各种细胞外基质结合附着在支气管肺泡上皮细胞。吞噬细胞作为抵抗真菌感染的首要防线，可吞噬侵入的微生物并产生杀伤作用(包括吞噬体的形成、细胞内pH的调节、营养物质的限制等)。当马尔尼菲篮状菌被吞噬细胞吞噬后，其可通过色素的合成、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶-过氧化物酶、热休克蛋白等多种机制抵抗吞噬细胞的氧化应激反应，从而使马尔尼菲篮状菌在吞噬细胞中存活并导致巨噬细胞裂解，继而引起播散性感染[14]。

马尔尼菲篮状菌具有yapA基因可编码Yap1类似物转录因子YapA。在酿酒酵母中，亮氨酸拉链蛋白家族中的Yap1是氧化应激反应的中枢调节器。细胞通过严格的调节机制调节细胞内过氧化物及其他活性氧的浓度。当细胞内活性氧浓度增高时，Yap1可在氧化应激条件下被激活。而Yap1功能的缺失将导致细胞对氧自由基的敏感度增高，同时导致超氧化物歧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、谷胱甘肽还原酶活性降低，引起细胞损伤[15]。马尔尼菲篮状菌中也具有Yap1的类似物YapA，Wiyada Dankai等[16]发现YapA的突变会导致发芽以及产孢的延迟，提高氧化应激反应的敏感性，从而导致真菌在吞噬细胞内存活率降低。这间接反映yapA基因参与了抗吞噬细胞的杀伤作用。

3 代谢合成相关的编码基因

3.1与黑色素合成相关的基因 黑色素是一类广泛存在于微生物中的一类特殊的色素，是真菌的一个重要的毒力因子，同时也为真菌的存活提供重要的保护作用。马尔尼菲篮状菌也分泌黑色素，并在马尔尼菲篮状菌的致病性和存活方面发挥重要的作用。研究发现，黑色素具有对抗各种非特异性压力(例如紫外线、氧化剂、酶裂解、极端高温和低温下)、清除氧自由基保护真菌免受由氧或氮衍生的自由基介导的损伤、调节免疫细胞因子水平及增强真菌对药物的抵抗性等作用[17-18]。

黑色素可根据其合成途径的不同可分为DOPA-黑色素和DHN-黑色素，目前认为马尔尼菲篮状菌既可通过DOPA途径，也可通过DHA途径合成黑色素[19-20]。在多种真菌中发现，黑色素的合成涉及多个基因簇，其中包括聚酮化合物、柱孢还原酶、羟基萘还原酶、多铜氧化酶、漆酶合成相关基因等[21]。在马尔尼菲篮状菌中也发现PKS合成相关基因及编码漆酶的基因参与黑色素的合成，PKS催化丙二醇CoA或者乙酸转化1,3,6,8-THN，漆酶在1,8-DHN转化为黑色素中起关键作用[20]，相关基因的突变可影响黑色素的合成。Woo等[22]发现敲除参与PKS合成的alb1基因的突变株合成的黑色素明显减少，且其感染小鼠的存活率明显高于野生株。同时，编码漆酶的pbrB基因的缺失同样会引起黑色素合成的减少。

3.2磷脂酶 细胞外磷脂酶作为一种可有效分解细胞膜脂质成分并裂解细胞膜的物质已被广泛证实可作为病原菌的一种通用毒力因子。磷脂酶是一类可水解甘油磷脂中一个或多个酯键的酶，根据其水解不同酯键的能力，可将磷脂酶分为磷脂酶A、B、C、D。在微生物侵入宿主过程中，裂解宿主细胞膜或破坏宿主细胞膜的功能是微生物突破进入宿主细胞内的必要环节，而磷脂酶可有效分解细胞膜的脂质成分导致细胞膜的损伤和裂解。这一功能是磷脂酶被认为细菌和真菌的重要毒力因子的重要原因。而在白色念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉等的研究都证实了磷脂酶与真菌的致病性密切相关[23]。Yan He等[23]研究表明细胞内磷脂酶B在马尔尼菲篮状菌酵母相(致病相)中表达明显高于菌丝相，同时证明了磷脂酶B在马尔尼菲篮状菌的致病性中发挥积极作用。虽目前尚无证据表明磷脂酶在马尔尼菲篮状菌致病机制中的作用，但可作为未来进一步研究方向。

3.3其他聚酮类化合物合成相关的编码基因 聚酮化合物是微生物广泛合成的次级代谢产物，包括色素、抗生素及真菌毒素等；其生物活性多样，可为微生物在宿主内存活提供生存优势。除了黑色素外，其他聚酮化合物也与马尔尼菲篮状菌的致病性密切相关。这类化合物的生物合成过程均产生含有多个酮基的中间产物，聚酮合酶(Polyketide synthase, PKS) 是催化这类中间产物合成的关键酶。其中马尔尼菲篮状菌的黄色素是由丝红醇及丝红酸组成，分别由PKS-11和PKS-12基因编码合成。其突变体产生的黄色色素明显低于野生型，且野生菌株在吞噬细胞的存活率高于突变株，表明由PKS催化合成的丝红醇及丝红酸可增强马尔尼菲篮状菌在巨噬细胞内存活率[24]。

4 MP1p蛋白及相关编码基因

MP1p是一种由MP1基因编码的细胞壁表面的甘露糖蛋白，曾作为一种免疫性抗原，用于马尔尼菲篮状菌感染的检测。但最新研究发现，MP1p是马尔尼菲篮状菌一种新的毒力因子，其在宿主体内的免疫应答中发挥重要作用[25]。MP1p共有462个氨基酸残基，包含3个结构域，分别为脂质结合域1(Mp1p-LBD1)、脂质结合域2(Mp1p-LBD2)及C-羧基末端富含丝氨酸和苏氨酸的区域[25]。Woo等[26]分别用含有MP基因、MP1互补基因、MP1敲除的马尔尼菲篮状菌菌株感染Balb/c小鼠，发现MP1的表达量与菌体在小鼠巨噬细胞的存活率呈现正相关。Kong-Hung Sze等[25]进一步研究发现Mp1p-LBD2是一种具有长疏水中心的5螺旋结构束状单体，对花生四烯酸(arachidonic acid, AA)具有极高的亲和力，可以捕获并封闭1-2个AA，使细胞内AA水平减少，进而抑制下游AA代谢产物及促炎性因子IL-6和TNF-a的释放，最终降低机体的炎症反应。

5 展 望

马尔尼菲篮状菌是一种双相真菌，具有区别于其他真菌的致病机制及机体相对应的防御机制。本文从分子层面回顾了马尔尼菲篮状菌致病机制，着重综述了菌体双相性转变的相关信号通路及可能调控基因，马尔尼菲被吞噬细胞吞噬后氧化杀伤的分子应答，以及其他致病毒力因子。马尔尼菲篮状菌首先通过相变的发生逃避宿主对一般真菌识别杀伤从而进入人体；其次在吞噬细胞中马尔尼菲篮状菌通过黑色素的产生以及一些代谢产物的形成的方式来逃避吞噬细胞的杀伤作用。此外，马尔尼菲篮状菌分泌了一种特殊的糖蛋白—Mp1p蛋白，这是一种新的毒力因子，其可通过捕获一种关键的脂质促炎因子以逃避宿主的先天性免疫防御，可为日后研究真菌如何逃脱宿主免疫提供新的见解及方法。但关于双相性转变的关键启动因子及其相关复杂网络的调控，以及躲避宿主免疫应答的具体机制，目前尚无明确定论，有待进一步研究。

利益冲突：无

引用本文格式：肖艳萍，钟桥石，胡龙华.马尔尼菲篮状菌致病机制相关分子研究进展[J].中国人兽共患病学报，2020，36(1):70-74. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.190