诺卡菌分子鉴定方法的研究进展*

黄 磊 综述，张 艺 审校

(北京大学第一医院检验科，北京 100034)

诺卡菌是一群需氧革兰阳性分枝杆菌，可存在于土壤、空气、水、动植物排泄物中，主要通过吸入或破损皮肤侵入人体引起感染，可引起局部或全身感染，好发于免疫功能低下患者(例如器官移植后，使用糖皮质激素，HIV感染等免疫抑制状态)，也可见于健康人[1- 2]。近年来国际上和我国有关诺卡菌感染的报道不断增多，日益受到关注[3-6]。

诺卡菌感染在临床及影像学上缺乏特异性，其诊断往往依靠实验室检测，涂片镜检的灵敏度低且不能鉴定到种，培养出可疑菌落后用生化方法仅有少数几种诺卡菌能鉴定到种[7]。诺卡菌有50多个种，其中脓肿诺卡菌、皮疽诺卡菌、巴西诺卡菌、新诺卡菌、豚鼠耳炎诺卡菌等13个菌种可引起人类感染，且不同菌种对抗菌药物的敏感性不同，所以对早期诊断和治疗，鉴定到种非常重要。

目前只有分子生物学方法能将诺卡菌准确鉴定到种，从早期的PCR扩增目的片段后电泳检测、PCR-限制性核酸内切酶分析、反向点杂交、焦磷酸测序等，发展到目前广泛应用的基因测序(16S rRNA、hsp65、recA1、gyrB和rpoB)、多位点序列分析(MLSA)和质谱(MALDI-TOF MS)技术[7]。以上方法各有优势和局限性，本文对目前广泛应用的3类方法作一综述。

1 基因测序

1.116S rRNA基因 细菌16S rRNA序列内同时存在高度保守和高度变异的区域，是一个稳定的遗传标记，可将细菌鉴定到种水平，获得不依赖表型特征的客观结果，是最早和最广泛用于诺卡菌鉴定的基因[1,8]。但是在诺卡菌中的某些种，该基因存在多拷贝现象，不同拷贝显示为不同的碱基序列，在测序峰图上显示为多个重叠峰。目前已知存在多拷贝基因的模式菌株包括凹陷诺卡菌、未知诺卡菌、山梨诺卡菌、新诺卡菌等，NCBI数据库中这些菌株的16S rRNA基因序列存在相当比例的错误[9-10]。此外16S rRNA序列也无法区分亲缘关系非常接近的诺卡菌，例如新诺卡菌复合体[11]。

XIAO等[12]针对诺卡菌16S rRNA基因5′端606 bp区域进行测序，以一致性≥99%作为判断标准，鉴定25株常见诺卡菌的准确率为96%，其中包括12株圣乔治诺卡菌、9株皮疽诺卡菌、2株脓肿诺卡菌和1株豚鼠耳炎诺卡菌，但是未鉴定出一些少见的种，比如华莱士诺卡菌。因此单独使用16S rRNA测序来鉴定诺卡菌有一定的局限性。

1.2hsp65基因 hsp65基因编码是相对分子质量为6.5×104的热休克蛋白，也可用于鉴定诺卡菌，既往研究多为比较其与16S rRNA基因测序对诺卡菌的鉴定能力。RODRGUEZ-NAVA等[13]评估了hsp65基因特定的441 bp区域对不同种诺卡菌的鉴定能力，发现该基因比16S rRNA拥有更多可变区，诺卡菌种间差异更显著，这种差异可用于区分某些16S rRNA序列非常相似甚至是100%一致的菌株，例如可以区分16S rRNA序列非常相似的塞拉多诺卡菌和老兵诺卡菌。

RUDRAMURTHY等[14]对来自印度的25株临床分离的诺卡菌同时用16S rRNA和hsp65测序，发现这两个基因均可鉴定90%的常见诺卡菌，例如皮疽诺卡菌、圣乔治诺卡菌等，同时也存在少量不一致的情况。由于GenBank中的北京诺卡菌、关节炎诺卡菌、亚洲诺卡菌的hsp65序列的信息很少，故使用hsp65序列比对不能很好地区分上述3种诺卡菌，而16S rRNA的长片段(1 000 bp以上)测序则可以。此外还发现hsp65基因在圣乔治诺卡菌中存在异质性，可用于该菌的进一步分子分型。

1.3secA1基因 secA1基因编码分泌蛋白A1，蛋白A1对于蛋白质通过细胞膜的输出非常重要。secA1基因特定的468 bp区域可用于诺卡菌鉴定。KONG等[15]在对120株诺卡菌临床分离株的研究中，发现用secA1基因的鉴定结果与16S rRNA的5′末端606bp序列的鉴定结果存在某些不一致，例如16S rRNA鉴定为新诺卡菌、脓肿诺卡菌、苛养诺卡菌和德兰士瓦诺卡菌的菌株，secA1基因则对相应菌株分别鉴定为诺卡菌某些种、亚洲诺卡菌、非洲诺卡菌、布氏诺卡菌。此外secA1比16S rRNA序列具有更多的序列多样性，尤其是新诺卡菌有14个序列型、皮疽诺卡菌和老兵诺卡菌各有7个序列型。因此secA1是16S rRNA鉴定的补充，并且可用于诺卡菌种系发育和亚型研究。此外secA1还可用于鉴定某些极少见诺卡菌，例如曾经在1例器官移植后患肺诺卡菌病的患者中用secA1测序方法鉴定出泰国诺卡菌，并与16S rRNA测序进行了比较，一致性很高，这是在全球范围内第3次报道该种诺卡菌[16]。

1.4gyrB基因 gyrB基因编码DNA旋转酶的β亚基，虽然某些菌种存在多重拷贝，但gyrB基因也可用于诺卡菌的菌种鉴定。TAKEDA等[17]对56株诺卡菌模式菌株的评估结果表明，gyrB基因1 200 bp范围内的种间差异度82.4%～99.9% (2～270个碱基差异)，是16S rRNA的种间差异的3.6倍。这表明gyrB比16S rRNA在诺卡菌鉴定中具有更高分辨率。CARROSCO等[18]的研究表明，gryB可用于临床常见诺卡菌鉴定、分型和亲缘关系比较，这包括脓肿诺卡菌、圣乔治诺卡菌、皮疽诺卡菌、新诺卡菌。CARROSCO等[19]的进一步研究表明，16S rRNA结合gyrB可提高常见诺卡菌的鉴定能力，这包括巴西诺卡菌、豚鼠耳炎诺卡菌，以及不常见诺卡菌，包括熊本诺卡菌、未知诺卡菌、寡食诺卡菌、肺炎诺卡菌、脓液诺卡菌、武田诺卡菌、老兵诺卡菌、酒红诺卡菌，但是未鉴定出其他12种诺卡菌。gyrB基因对于肉诺卡菌、德兰士瓦诺卡菌、巴西诺卡菌和豚鼠耳炎诺卡菌的鉴定率较高。

1.5rpoB基因 rpoB基因编码DNA依赖的RNA聚合酶的β亚基，也可用于诺卡菌鉴定，但目前单独评价该基因的文献报道较少，已有报道多为将rpoB的测序结果作为多为点序列分析(MLSA)的一部分。CARROSCO等[18]研究表明，rpoB基因在脓肿诺卡菌、圣乔治诺卡菌、皮疽诺卡菌和新诺卡菌复合体，比16S rRNA具有更高的基因多态性，而16S rRNA用于鉴定脓肿诺卡菌和新诺卡菌复合体时效果不好，因此rpoB是16S rRNA测序的有益补充。

2 多位点序列分析(MLSA)

由于使用单个基因测序存在不足，MCTAGGART等[20]最早对190株临床分离的诺卡菌和36株模式菌株，采用MLSA方法，同时测序16S rRNA、gyrB、secA1、hsp65、rpoB基因，然后把5个基因的测序结果串联在一起，创建基于序列的种系发生簇，结果显示71.3%的临床株可与模式株聚类在一起，从而鉴定到种水平，也可以鉴定出之前未曾报道过的新种。并且发现3个基因位点组合(gyrB-16S-secA1)和4个基因位点组合(gyrB-16S-secA1-hsp65)与5个基因位点组合具有相当的鉴定能力，鉴定一致率分别为98.5%和95.5%。并且研究中发现，单独使用hsp65和rpoB时，得到的鉴定结果与MLSA的结果存在显著差异，这可能是因为MLSA检测多个基因时削弱了单个基因序列中有差异的等位基因的影响。

CARRASCO等[8]用4个位点MLSA鉴定了67株经16S rRNA测序和质谱方法鉴定不一致的诺卡菌，结果表明MLSA在少见诺卡菌种，如塞拉多诺卡菌、未知诺卡菌、肺炎诺卡菌的鉴定能力很好，而不能区分经16S rRNA鉴定为华莱士诺卡菌和布氏诺卡菌(质谱方法仅对这两种诺卡菌给出了不可靠的鉴定结果)，MLSA也不能区分短链诺卡菌/寡食诺卡菌、关节炎诺卡菌/微白诺卡菌、克鲁切克诺卡菌/青叶町诺卡菌、非洲诺卡菌/新诺卡。

XIAO等[12]用五位点MLSA(16S rRNA-gyrB-secA1-hsp65-rpoB)和16S rRNA测序同时鉴定25株诺卡菌临床分离株，其中24株的鉴定结果一致，且MLSA能够准确鉴定华莱士诺卡菌，而16S rRNA测序不能，并且MLSA将圣乔治诺卡菌进一步分为3个亚群。因此MLSA比16S rRNA具有更高的分辨率。

3 基质辅助激光解吸电离-时间飞行质谱(MALDI-TOF MS)技术

MALDI-TOF MS技术根据不同微生物蛋白质的核质比差异，将单个菌株的质谱图谱与数据库中的质谱图谱进行比较，从而得到鉴定结果，近年来由于其通量增加和潜在的优势，已逐渐用于诺卡菌鉴定[21]。

BLOSSER等[22]的多中心研究评价了使用经FDA和CFDA认可的商品化布鲁克MALDI-TOF MS质谱仪对150株诺卡菌的鉴定结果，他们使用了标准化的培养、蛋白提取和质谱鉴定方法。结果表明，86%菌株准确鉴定到种/种复合群水平，6%菌株未出鉴定结果，4%通过现有数据库(布鲁克的参考数据库、美国国立卫生院的诺卡菌补充数据库、俄亥俄州立大学的诺卡菌补充数据库)鉴定为少见种，对这些鉴定不理想的菌株重新提取蛋白检测，并使用自建数据库比对，使鉴定结果在种水平和属水平的一致性分别提高了18.2%和36.9%。

BUCKWALTER等[23]使用布鲁克MALDI-TOF MS质谱仪评估了质谱方法和16S rRNA测序在148株诺卡菌鉴定中的一致性，发现当使用厂家提供的商品化数据库(布鲁克的参考数据库、布鲁克的分枝杆菌特异性数据库)时正确率仅42%，当使用客户实验室自建数据库时正确率可达90%，说明厂家提供的商品化数据库存在一定的局限性，主要因为该库中的诺卡菌图谱多为模式菌株，而缺少足够数量的临床菌株图谱，尤其是少见诺卡菌。

CARRASCO等[8]使用布鲁克MALDI-TOF MS质谱仪和布鲁克的参考数据库分析了西班牙地区高分离率(25株)、中分离率(20株)和低分离率(55株)的诺卡菌，结果表明MALDI-TOF对高分离率菌株的鉴定一致率与16S rRNA测序相当(达76%)，对中分离率和低分离率菌株则存在较大差异，一致率分别为45%和27%。

XIAO等[12]的研究表明，使用布鲁克MALDI-TOF MS质谱仪检测25株诺卡菌临床分离株，当使用布鲁克的参考数据库时，上述菌株均未鉴定成功；当使用已知鉴定结果的5株菌的图谱进行实验室自建数据库时，上述菌株有95%可准确鉴定到种水平(≥2.0分)。此外用MALDI-TOF不能准确鉴定出亲缘关系很近的种，如新诺卡菌复合体成员。

GIRARD等[24]使用经FDA和CFDA认可的商品化威泰科(VITEK) MALDI-TOF MS质谱仪检测164株诺卡菌临床分离株，他们优化了样本制备流程，并使用即将面世的VITEK MS IVD数据库(3.0版)。其结果与16S rDNA测序进行比对，一致率为94%，仅有少量不常见的诺卡菌鉴定错误。该结果与使用布鲁克质谱仪及其相应数据库得到的结果相比，显示出很大的优越性[8,12,22-23]。

综上所述，MALDI-TOF用于诺卡菌鉴定最主要的局限性是现有商品化数据库中缺乏相应的图谱，某些诺卡菌模式菌株的质谱图谱与临床株不同，因此当遇到不常见诺卡菌时，需要用已鉴定好的临床菌株建立和完善原有数据库。当遇到某个种可能含有质谱图虽不同，但又关联的菌株时，比较同一种诺卡菌的所有质谱图可提高鉴定准确率。因此对诺卡菌的鉴定来说，仍需进一步丰富现有的商品化数据库，尤其是不常见诺卡菌的数据库。

4 小 结

目前，仅有分子生物学方法可将诺卡菌准确鉴定到种，其中应用较广泛的方法包括基因测序(16S rRNA、hsp65、secA1、gyrB和rpoB)、MLSA和MALDI-TOF MS技术。在基因测序方法中，16S rRNA基因是应用最早、最广泛的目的片段，对于常见诺卡菌具有较好的鉴定准确度，但在某些少见诺卡菌中因存在基因多拷贝现象，而无法准确鉴定。hsp65、recA1、gyrB、rpoB与16S rRNA相比，在不同种诺卡菌中具有更高的基因序列多态性，在鉴定少见诺卡菌和亲缘关系非常接近的诺卡菌时，是16S rRNA的有益补充。MLSA是将上述基因中的3～5个分别测序后串联在一起构建种系发生簇，根据种系间的亲缘关系来鉴定菌株，比单个基因测序具有更高分辨率。质谱技术简便、快速、成本低，可高通量检测，但现有的商品化数据库中缺乏足够的临床菌株图谱，直接使用效果较差，实验室依据临床菌株自建数据库后，鉴定准确度可显著提高。