响应面法优化高脂酸奶发酵工艺及其品质分析

朱静静，张红彩，赵存朝，黄艾祥，王雪峰，2*，陈越

1. 云南农业大学食品科学技术学院（昆明 650201）；2. 云南省畜产品加工工程技术研究中心（昆明 650201）；3. 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所（昆明 650223）

发酵乳制品以其特有的营养及保健功能深受大众喜爱，含有人体需要的各种营养成分，比鲜奶更容易吸收[1]。近些年，低脂酸奶热度渐减，而享受型全脂酸奶正在回归，具有醇厚口感、饱腹感的全脂酸奶更是受到广大消费者的青睐。高脂酸奶是以生鲜牛乳为原料，奶油和乳清蛋白粉等为辅料，经乳酸菌发酵而成。其中，乳清蛋白粉的加入可提高蛋白质含量，改善其风味和质地，以及减少乳清析出而延长保质期[2-4]；奶油的添加还可以改善高脂酸奶的感官品质，快速补充能量，增加饱腹感[5-6]。该产品可直接食用或涂于面包、蛋糕和焙烤类食物上食用，有望成为酸性奶油的替代品。

试验在不影响奶油口感和营养品质的前提下，将奶油添加到鲜牛乳中，与乳清蛋白粉、蔗糖等辅料互配进行发酵，经过特定的发酵工艺制成高脂酸奶。以感官评分值为主要评价指标，通过单因素试验和响应面试验优化高脂酸奶的最佳发酵工艺条件，并对其进行品质分析，为后续该产品的生产应用提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验材料

生鲜牛乳、淡奶油、白砂糖、三花调制乳、乳清蛋白粉（WPC35），均为市售。

1.1.2 菌株与培养基

CICC 6063嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、CICC 6064瑞士乳杆菌（Bulgaria lactobacillus），购自中国工业微生物菌种保藏中心；MRS培养基、MRS肉汤，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 仪器与设备

SVJ-358型智能型酸奶机，北京世纪阳光有限公司；STARER 3100型pH计，奥豪斯仪器有限公司；JJ-05725型均质机，廊坊通用机械制造公司；SGK-2 LB型低噪音空气泵，北京东方精华苑科技有限公司；XS-402型脂肪测定仪，南京光学有限公司；KDY-9810型凯氏定氮仪，北京电子技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 发酵菌种活化及配比

分别取适量乳杆菌菌株冻干粉进行3次活化得到菌悬液，将活化后的乳酸菌接种到原料乳中驯化增殖，依次调整菌种接种量为3%（0.3×106CFU/mL）、4%（0.4×106CFU/mL）、5%（0.5×106CFU/mL），37℃恒温培养至凝乳，反复传代，以达到试验要求，保证菌种活力能在4 h内凝乳。选取活性最强的嗜热链球菌和瑞士乳杆菌以4%的接种量按（1∶1，1∶2，1∶3，2∶1和3∶1）5种配比进行复配，以感官评分为指标，确定高脂酸奶发酵菌种的最佳配比。

1.2.2 高脂酸奶发酵工艺流程

鲜牛乳→添加配料→搅拌混匀→65 ℃预热→二次均质（5～8 MPa、9～10 MPa各均质一次）→85 ℃杀菌30 min→冷却至40～45 ℃→接种乳酸菌发酵剂→灌装→30 ℃条件下恒温发酵35 h→放入2～4 ℃冰箱冷藏24 h

1.2.3 感官评分

参照GB/T 15691—2008[7]，随机抽取20瓶样品，在自然光线下，用肉眼观其色泽，闻其香味，并取少许放入舌尖，涂布满口，品尝其滋味，具体感官评分标准见表1。

表1 高脂酸奶感官评分标准

1.2.4 发酵工艺优化单因素试验

以感官评价为评分指标，分别考察发酵温度（25，30，35，40和45 ℃）、乳清蛋白粉添加量（质量分数为1.2%，1.4%，1.6%，1.8%和2.0%）、发酵剂添加量（质量分数为1%，2%，3%，4%和5%）、奶油与生鲜牛乳体积比（1∶0.5，1∶1，1∶1.5，1∶2和1∶2.5）、蔗糖添加量（质量分数为10%，12%，14%，16%和18%）、发酵时间（20，25，30，35和40 h）、后熟时间（12，24，36，48和60 h）7个因素对高脂酸奶感官品质产生的影响。

1.2.5 响应面试验设计

在单因素试验基础上，利用Box-Behnken试验设计，选取奶油与鲜牛乳的体积比（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、后熟时间（D）4个因素，以感官评分值为响应值，通过响应面分析方法优化高脂酸奶的制备工艺，分析水平见表2。

1.2.6 高脂酸奶的理化指标、乳酸菌活菌数测定

1.2.6.1 pH

采用防水型pH微测试笔。

1.2.6.2 酸度

参照GB 5413.34—2016[8]。

1.2.6.3 持水力

参照卢孝洁等[9]的方法。

1.2.6.4 蛋白质

参照GB 5009.5—2016[10]。

1.2.6.5 脂肪

参照GB 5009.6—2016[11]。

1.2.6.6 乳酸菌活菌数

参照GB/T 1634—1996[12]。

1.2.7 高脂酸奶的氨基酸测定

1.2.7.1 样品处理及其衍生

参照王逍君等[13]的方法并进行修改。准确称取2 g酸奶，置于20～30 mL安瓿瓶中，加入10 mL含0.1%苯酚的6 mol/L盐酸，振摇使酸奶溶解或使酸奶均匀分散于溶液中，将安瓿瓶置于-20 ℃冰箱中冷冻3～5 min，充氮后用喷灯熔封，然后置于110 ℃左右的烘箱中水解24 h，取出冷却，取水解液1 mL，置于浓缩仪中浓缩至干（或用氮气吹干去除盐酸），加入1 mL的0.1 mol/L稀HCl溶解，再用0.45 μm滤膜过滤。

参照王雪峰等[14]的方法并进行修改。准确量取氨基酸标准溶液及样品水解液200 μL，分别置于1.5 mL离心管中，往每个离心管中准确加入正亮氨酸内标溶液20 μL，每个离心管中分别加入三乙胺乙腈溶液100 μL、异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混匀，室温放置1 h，然后加入正己烷400 μL至各离心管，振摇后放置10 min，取下层溶液（PTC-AA），用0.45 μm针式滤器过滤，取滤液200 μL，加800 μL水稀释，摇匀，待测。

1.2.7.2 样品测定

色谱条件：Venusil AA氨基酸分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温40 ℃；进样量10 μL；波长254 nm；流速1.0 mL/min。流动相A：称取15.2 g无水乙酸钠，加水1 850 mL，溶解后用冰醋酸调pH至6.5，然后加乙腈140 mL，混匀，用0.45 μm滤膜过滤。流动相B：80%乙腈溶液。

洗脱梯度如表3所示。

表3 流动相洗脱梯度

1.2.7.3 结果计算

根据标准物质的保留时间定性，内标法定量。

式中：f1为样品溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积；f2为混合氨基酸标准溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面；C为氨基酸对照品，μ g/mL。

式中：V为样品溶液的定容体积，mL；W为样品质量，g。

1.2.8 高脂酸奶产香能力的测定

参照李娅等[15]方法测定后熟24 h、pH 3.32的高脂发酵乳中的乙醛、丁二酮含量，评价其产香能力。

1.2.9 数据处理

每个样品至少3次重复数据，以平均值（AV）±标准差（SD）表示。通过SPSS 17.0软件对数据进行方差显著性分析，p＜0.05时表示差异显著。最小显著差异法用于数据多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 高脂酸奶发酵菌种的确定

由图1可知，嗜热链球菌和瑞士乳杆菌比例为1∶2时感官评分值最高；嗜热链球菌在发酵过程中主要产生乳酸和叶酸，增加酸奶黏度，可缩短酸奶凝乳时间，而瑞士乳杆菌则产生大量乳酸和特殊香味物质[16]。因此，选取嗜热链球菌与瑞士乳杆菌比例1∶2为最佳的发酵菌种复配比例。

图1 菌种发酵剂比例对高脂酸奶感官品质的影响

2.2 高脂酸奶发酵工艺单因素试验

2.2.1 奶油与生鲜牛乳体积比对高脂酸奶感官品质的影响

由图2可得知，随着奶油与生鲜牛乳体积比的增加，高脂酸奶产品的感官评分值出现先升后降的趋势。比例过高过低都会导致感官评分值降低，比例过低酸奶的凝固状态和风味不足，比例过高则有大量脂肪上浮，影响产品状态。因此，选取奶油与生鲜牛乳体积比1∶1.5为最佳比例。

图2 奶油与生鲜牛乳体积比对高脂酸奶感官品质的影响

2.2.2 蔗糖、发酵剂、乳清蛋白粉添加量对高脂酸奶感官品质的影响

江岸区位于武汉市中心地带，是武汉市委、市政府所在地，辖区面积70.25平方公里，户籍人口71.11万，常住人口100余万，为居民日常生活供应蔬菜的农贸市场现有36家，蔬菜农药残留的多少直接决定了居民餐桌饮食安全与否。把握源头是食品安全监管的关键，降低居民餐桌饮食风险，必须紧紧抓住蔬菜农残检测这个“牛鼻子”。

由表4可知，蔗糖添加量、发酵剂添加量、乳清蛋白粉添加量质量百分数分别为16%，3%和1.6%时感官品质达到最好。蔗糖可为人体增加能量、增加酸甜口感、缩短发酵时间，添加量过少会影响发酵效果，添加过多酸甜味不协调，严重影响口感[17]；发酵剂可为牛乳提供益生菌，但是过高会对人体产生一定的危害，过低则发酵不完全[18]；乳清蛋白粉的加入可提高酸奶蛋白质含量，提高营养价值，增强其持水性[4]。

表4 蔗糖、发酵剂、乳清蛋白粉添加量对高脂酸奶感官品质的影响

2.2.3 发酵温度对高脂酸奶感官品质的影响

由图3可知，高脂酸奶发酵过程中随着温度逐渐提高，感官评分呈先上升后下降的趋势，30 ℃时的感官评分最高，可能是由于随着发酵温度的提高，使乳蛋白变性，使高脂酸奶产生怪味或异味，影响感官评分。

图3 发酵温度对高脂酸奶感官品质的影响

2.2.4 发酵时间对高脂酸奶品质的影响

由图4可以看出，发酵时间达到35 h时感官评分值达到最高，之后逐渐下降。发酵时间过短时，乳蛋白的交互结构形成不充分，不能包裹乳中原有的水分使乳清大量析出[19]；发酵时间过长，酸奶凝乳较好，无乳清析出，但长时间发酵导致乳酸菌大量繁殖，菌种大量损耗，影响其风味[20]。

图4 发酵时间对高脂酸奶感官品质的影响

2.2.5 后熟时间对高脂酸奶感官品质的影响

由图5可知，随着后熟时间的延长，感官评分呈先上升后下降的趋势，后熟24 h的感官评分最高，可能由于随着发酵乳后熟过程中时间的延长，高脂发酵乳中的风味物质被损耗或转化为其他物质，导致感官品质受到影响。

2.3 响应面法优化

2.3.1 响应面试验设计及结果

根据单因素试验结果，建立Box-Behnken Design中心组合设计试验模型，通过拟合二次方程计算最优工艺组合。选择奶油与生鲜牛乳体积比（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、后熟时间（D）四因素三水平响应平面试验，试验结果见表5。

图5 后熟时间对高脂酸奶感官品质的影响

表5 响应面分析方案及结果

利用软件对表6进行多元回归拟合，得到高脂发酵乳感官评分对奶油与生鲜牛乳体积比（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、后熟时间（D）的二次方程模型为：Y=61.33+5.52A-0.53B-3.87C-1.2D-6.13AB-1.47AC+1.8AD+1.47BC+1.16BD-5.07CD+5.59A2+2.32B2-3.75C2+1.53D2。

回归模型的方差分析结果见表6。

表6方差分析可知：回归模型显著性检验p=0.000 5＜0.01，说明二次多元回归模型极显著；感官评分回归模型失拟性检验p=0.096 9＞0.05，可认为二次回归模型与实际试验拟合性充分模型失拟不显著。CV表示试验本身的精度，CV值越小，试验的可靠性越高，试验中CV比较低，为5.68%。

表6 感官评分回归模型方差分析

综上所述，回归模型拟合程度良好，试验误差小，说明试验操作可信度高，具有一定的实用性指导意义。各因素的F值越大，说明影响越显著[21]，以上模型可看出各因素对高脂酸奶感官品质影响的顺序为：（A）奶油与生鲜牛乳体积比＞（C）发酵时间＞（D）后熟时间＞（B）发酵温度。

2.3.3 响应面优化分析

通过观察图6中响应面的变化情况和等高线的稀疏程度可直观地反映奶油与生鲜牛乳体积比（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、后熟时间（D）交互作用对高脂酸奶感官品质的影响，当响应面图呈椭圆形或马鞍形时，表示两因素交互作用显著[22]。

图6和图7为有二次回归方程拟合得到的响应值Y的等高线及三维曲面图，是回归方程的形象描述。由等高线图可知，A与B，C与D之间成马蹄形，说明交互作用显著（p＜0.05）。奶油与生鲜牛乳体积比响应面坡度较发酵温度的陡峭，说明其对高脂酸奶感官品质的影响比发酵温度大；发酵时间坡度比后熟时间的陡峭，说明发酵时间对高脂酸奶感官品质的影响比后熟时间大。结果与方差分析结果一致。

图6 奶油与生鲜牛乳体积比（A）、发酵温度（B）对感官评分的影响

图7 发酵时间（C）、后熟时间（D）时间对感官评分的影响

2.3.4 最佳条件的确定和回归模型的验证

由表7可知回归模型通过响应面法得到高脂发酵乳工艺条件为高脂酸奶的最佳发酵工艺为：奶油与生鲜牛乳体积比1∶1.5、糖的添加量16.4%、乳清蛋白粉添加量1.6%、发酵剂的添加量3%、发酵温度30℃、发酵时间35 h、后熟时间24 h。此时感官评分值为88.15。考虑实际操作情况与设备参数状况，将糖的添加量调整为16%，在上述最佳条件下进行验证试验，得到高脂发酵乳感官评分平均值为87.12，与理论值接近，说明该回归模型得到的优化参数准确性高。

表7 最佳条件的确定和回归模型的验证

2.3.5 高脂酸奶的理化指标、乳酸菌活菌数测定

在最优发酵工艺条件下，测定高脂酸奶产品的的理化指标、乳酸菌活菌数，见表8。

由表8可知，此工艺条件下得到的高脂酸奶产品质量符合发酵乳的食品安全国家标准。其中，蛋白质含量是普通酸奶含量的2倍，脂肪含量几乎是普通酸奶的4倍（普通酸奶脂肪含量在3.0 g/100 g左右）。因此，该产品可作为酸性奶油的替代品，且风味优于普通酸奶。

表8 高脂酸奶的理化指标、乳酸菌数测定

2.3.6 高脂酸奶中氨基酸种类及含量分析

图8 17种氨基酸标准品色谱图

图9 普通酸奶样品氨基酸色谱图

图10 高脂酸奶样品氨基酸色谱图

表9 普通酸奶与高脂酸奶样品中氨基酸含量比较

由表9可以看出，普通酸奶（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为发酵菌种，鲜牛乳为原料，白糖添加量8%、发酵温度43 ℃、发酵时间8 h）与高脂酸奶的氨基酸种类及含量存在较大差异，高脂酸奶氨基酸组成中精氨酸、苏氨酸、异亮氨酸含量明显高于普通酸奶，但氨基酸总量（0.021 0%）要低于普通酸奶氨基酸总量（0.039 4%），主要是由于高脂酸奶加工原料中鲜牛乳含量小于普通酸奶，经过低温长时发酵，氨基酸损耗较大，氨基酸可能被消耗或者转化为其他物质[23]。

2.3.7 高脂酸奶产香能力的测定

乙醛和丁二酮是构成发酵乳风味的主要成分，赋予发酵乳特殊的香味[15]。高脂酸奶在后熟24 h阶段，测得其乙醛、丁二酮含量较高，分别为60.06和34.68 mg/L，是赋予该产品特殊酪香味的主要原因。

3 结论

试验通过单因素试验和响应面试验，确定了高脂酸奶的最佳发酵工艺条件为：菌嗜热链球菌与瑞士乳杆菌按1∶2的菌株比例复配、4%的接种量，奶油与生鲜牛乳体积比1∶1.5、糖的添加量16%、乳清蛋白粉添加量1.6%、发酵剂添加量3%、发酵温度30 ℃、发酵时间35 h、后熟时间24 h。此条件下所得产品凝固性好、口感爽滑、酸甜适中、饱腹感足、具有特殊的酪香味，产品中蛋白质含量4.24 g/100 g、脂肪含量12.26 g/100 g、滴定酸度90.7 °T、乳酸菌活菌数达1.86×106CFU/mL、乙醛与丁二酮含量分别为60.06和34.68 mg/L。所得产品成本低于现售淡奶油产品，有望成为酸性奶油的替代品。