江西地区育龄女性HCY 水平及其亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性分析

徐永华，刘艳秋，张兆振，赵凤

（江西省妇幼保健院产前诊断中心，南昌330006）

出生缺陷是一个全球性问题,尤其在发展中国家，我国出生缺陷高达5.6%，每年新增出生缺陷数约为90 万例，而叶酸摄入不足或者不能被有效吸收利用是导致出生缺陷的主要原因之一[1]。因此孕妇体内需摄入足够的叶酸营养来应对自身健康和胎儿生长发育的需要。 同型半胱氨酸（ HCY）是人体内一种含硫氨基酸， 是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程的中间产物， 亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是参与叶酸转运和代谢的关键酶，其碱基突变会引起酶活性的改变， 导致5-甲基四氢叶酸合成不足，引起叶酸代谢异常，使得HCY 向蛋氨酸转换障碍，這样导致体内HCY 聚集。 高HCY与出生缺陷如神经管缺陷（NTDs）、唇腭裂等以及复发性流产、妊高症、妊娠期糖尿病等疾病密切相关[2-5]。 因此我们通过对江西地区育龄女性HCY 水平及MTHFR C677T 基因型的测定，以了解本地区HCY 水平与叶酸代谢基因MTHFR C677T 基因型相关性，从而制定个体化叶酸补充方案，指导育龄女性合理补充叶酸， 为预防出生缺陷提供个体化干预措施提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2213例2018年9 月-2019年5月间在本院进行孕前或孕期叶酸代谢检测的育龄女性，年龄17-48岁,分别空腹采集3-4ml 黄色分离胶管静脉血，2h 内3000r/5min 离心检测，不能完成检测的标本2-8℃冷藏保存，2d 内完成检测；采集静脉血2-3ml 注入EDTA-K2 抗凝管中混匀。

1.2 仪器与试剂 HCY 水平检测仪器为生化仪颐兰贝ES-200， 试剂为安图生物有限公司生产；MTHFR C677T 基因型检测所用到的检测试剂盒、DNA 提取试剂盒、BR-526-24 全自动杂交仪、生物芯片读取仪以及PCR 仪均来自上海百傲科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HCY 采用循坏酶法检测 成人HCY 参考范围：0-15μmol/L 。

1.3.2 DNA 提取扩增 使用DNA 提取液提取200μml 全血中的DNA, 进行PCR 扩增反应，MTHFR C677T 扩增液22μl,反应液A 1Μl,基因组DNA 2μl； 在50℃5min；94℃5min；94℃25s，72℃25s 的扩增条件下35 个循环；72℃5min，同时设置阴阳性对照物，获取的扩增产物进行杂交反应。

1.3.3 采用PCR-芯片杂交法检测MTHFR C677T基因多态性，根据百傲试剂说明书方法进行杂交反应，杂交结果采用生物芯片读取仪读取，根据芯片图像分析软件进行数据分析样本基因型， 其基因型分为：野生型（CC 型）、杂合突变型（CT 型）和纯合突变型（TT 型）。

1.4 统计学分析 采用Hardy-Weinberg 遗传平衡检验对人群基因型进行分析， 采用SPSS19.0 统计软件进行数据处理，计数值以百分率表示，采用卡方检验比较组间差异；计数量值以均数±标准差(±s)表示，采用t 检验比较组间差异，以P＜0.05 为差异统计学意义。

2 结果

2.1 育龄女性不同年龄组HCY 水平与MTHFR C677T 基因型分析 2213 名育龄女性根据年龄分为≤35 岁（低龄组）和＞35 岁（高龄组）2 组，低龄组HCY 水平为（10.47±2.67）μmol/L，高龄组HCY 水平为（10.41±3.51）μmol/L，低龄组MTHFR C677T基因型分布情况：CC 型39.3%（117/298）、CT 型47.6%（142/298）、TT 型13.1%（39/298）， 高 龄 组MTHFR C677T 基因型分布情况：CC 型39.4%（755/1916）、CT 型45.3%（868/1916）、TT 型15.2%（292/1916）。 结果显示： 两不同年龄组育龄女性HCY 水平比较（t 值=-0.403，P=0.34），两不同年龄组育龄女性MTHFR C677T 基因型比较 （χ2=1.11,P＞0.573）。 提示两组育龄女性HCY 水平及MTH FR C677T 基因型比较无统计学差异。 见表1。

表1 不同年龄组HCY 水平及其MTHFR C677T 基因型分布

2.2 育龄女性MTHFR C677T 基因型与等位基因频率分布情况分析 2213 名育龄女性MTHFR C677T 基因型分别为野生型CC 型39.4%（872/2133）、杂合突变型CT 型45.6%（1010/2133）、纯合突变型TT 型15%（331/2213），等位基因C、T 的检出 频 率 分 别 为62.2%（2754/4426）、37.8%（1672/4426）,符合H-W 遗传平衡，样本具有区域群体代表性。

2.3 MTHFR C677T 不同基因型的HCY 水平情况2213 名育龄女性血清HCY 水平（10.46±2.8）μmol/L,高值（＞15μmol/L）88 例，占总数3.97%。 MTHFR C677T 基因型分为野生型（CC 型）872 例，HCY 水平为（9.9±1.9）μmol/L、 杂合突变型（CT 型）1010例，HCY 水平为（10.33±2.34）μmol/L、纯合突变型（TT 型）331 例，HCY 水平为（12.37±4.6）μmol/L。结果提示：3 组MTHFR C677T 不同基因型的HCY水平有显著差异,差异有统计学意义（P 均=0.000），异常值表现为TT 型＞CT 型＞CC 型，差异有统计学（P 均＜0.005）。 见表2。

表2 MTHFR C677T 不同基因型的HCY 情况

2.4 本地区MTHFR C677T 基因型分布与全国其他地区比较 本组与MTHFR C677T 基因型及其等位基因分布与武汉、湖州、云南等地报道数据差异无统计学意义，与河北、郑州、山东、山西、南宁、琼海、江门等地统计数据差异有统计学意义，结果提示：各地区MTHFR C677T 基因型及等位基因分布有南北差异，呈现北高南低。 大部分地区MTHFR C677T 基因型分布以CT 型为主， 但是其中南宁、琼海、江门以CC 型为主。 见表3。

3 讨论

MTHFR 是叶酸代谢过程的关键酶，其多态性与出生缺陷疾病密切相关[6]，MTHFR C677T 位点是我国人群常见的多态性位点， 该位点突变导致酶活性下降可引起叶酸水平降低和HCY 水平升高。有研究结果表明,母亲为CT 型携带者其子代发生神经管缺陷（NTDs）的风险为CC 型母亲携带者子代的2.06 倍， 母亲为TT 型携带者其子代发生NTDs 的风险为CC 型母亲携带者子代的3.12 倍[7]。

研究结果显示：HCY 水平在超过35 岁的高龄组和35 岁以下的低龄组比较差异无统计学意义，这一结果与宋妙丽等[8]结果一致，但与李杰等[9]的结果不同，可能与其研究样本量较少有关，我们的结果还显示，两组年龄组MTHFR C677T 基因型分布比较无统计学差异。但是3 组MTHFR C677T 基因型的HCY 水平和异常值率比较差异显著，（P均=0.000）差异有统计学意义，且表现为TT 型＞CT型＞CC 型。 说明HCY 水平与MTHFR C677T 基因型有相关性,這一点符合文献报道[7]，进一步证实了MTHFR C677T 基因突变可能导致高HCY 血症。

表3 本地区MTHFR C677T 基因型及等位基因的分布与其他区域的比较

大量研究表明，MTHFR C677T 基因型分布具有地域差异,我们统计了武汉、湖州、琼海等10 个地区,分析发现,江西地区与武汉、湖州、云南等地报道数据比较差异无统计学意义,与河北、郑州、山东、山西、南宁、琼海、江门等地统计数据比较差异有统计学意义, 结果提示: 各地区MTHFR C6 77T基因型及等位基因分布有南北差异， 呈现北高南低。 大部分地区MTHFR C677T 基因型分布以C T型为主,但是其中南宁、琼海、江门以CC 型为主。

增补叶酸已逐渐成为成为全球干预出生缺陷有效措施，但是增补叶酸存在地域和人群的差异，况且叶酸增补过多也会带来意外风险和负面影响[10]。为育龄女性制定个性化的叶酸增补方案是临床的一个发展趋势，因此，有必要针对育龄女性进行HCY 水平和MTHFR C677T 基因型的检测， 根据HCY 水平、 叶酸及MTHFR C677T 基因型检测结果，并结合孕产史，饮食结构等综合评估叶酸代谢能力，为育龄女性补充叶酸提供合理化建议，已期达到降低出生缺陷的目的。