染色体微阵列分析在神经系统发育异常胎儿中的应用

谭玲珑,刘艳秋,黄婷婷,邹永毅

(江西省妇幼保健院产前诊断中心，南昌330006)

胎儿神经系统发育异常是最常见的先天性畸形之一，主要包括侧脑室增宽、脑积水、全前脑、无脑儿、 脉络丛囊肿、 小脑延髓池增宽、Dandy—walker 综合征、胼胝体发育不良、颅内肿瘤、颅后窝结构畸形等。 导致畸形的病因可分为遗传性因素、感染性因素、化学性因素或环境因素等[1]。 目前，应用于检测胎儿畸形的常见染色体检查方法主要是传统G 显带染色体核型分析[2]。 然而，G 显带染色体核型分析仅能检出非整倍体染色体数目异常和较大片段的结构异常， 即使利用高分辨显带技术也仅限于检出4-5Mb 以上的染色体异常[3]。 并不能检出染色体微缺失和微重复，然而微缺失和微重复与胎儿神经系统发育异常具有相关性。染色体微阵列分析技术 (Chromosome Microarray Analysis,CMA)是新近出现的用于检测染色体微缺失和微重复的一项技术， 能将染色体拷贝数变异 （ copy number variations, CNVs）检出率提高到10% 以上[4,5]。 与传统染色体核型分析技术相比，CMA 分辨率高，能检出大于400kb 的CNVs，准确分析染色体微缺失微重复异常及相关并发症。而且该项技术不需要对标本进行培养， 大大减少实验人员操作时间及流程，可以很快向患者告知诊断结果[6]。 本研究对140 例产前超声提示神经系统发育异常，伴或不伴其他系统结构异常的胎儿标本采用染色体微阵列分析技术进行全面系统分析，探讨CMA 在神经系统发育胎儿产前诊断中的应用价值， 现将结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018 年1 月至2019 年6 月因产前超声提示胎儿表现为神经系统发育异常至江西省妇幼保健院产前诊断科行侵入性产前诊断的孕妇，共计140 例，根据是否合并其他系统结构异常， 将胎儿样本分为单纯神经系统发育异常胎儿组和复合神经系统发育异常胎儿组。 所有孕妇行手术之前均签署产前诊断知情同意书， 明确手术流程、手术风险及染色体微阵列分析技术、染色体核型分析技术的意义、局限性，产前诊断方法根据孕周不同包括羊膜腔穿刺术和脐静脉血穿刺术。 所有标本同时进行染色体微阵列分析和细胞染色体核型分析。

1.2 研究方法 样本采集：所有孕妇在签署手术知情同意书的情况下，行无菌消毒，用B 型超声波仪进行胎儿、胎盘定位，避开损伤胎儿和胎盘的位置进针，无菌抽取标本羊水或脐血。 DNA 提取：采用Qiagene DNA 提取试剂盒提取DNA。 染色体微阵列：采用美国Affy-metrix 公司750K 芯片试剂盒及美国Clontech 公司DNA 扩增试剂盒， 首先采用NspI 酶将DNA 随机消化为短片段，并进一步连接补齐消化后产物末端。其次PCR 扩增，并利用磁珠法纯化、片段化，将产物标记，后与芯片杂交，最后洗片、染色，扫描获取数据并进一步采用Chas v4软件进行分析及结果判读。

1.3 统计学分析 应用统计学软件SPSS 19.3 组与组之间t 检验对两组样本进行比较分析， 定义P<0.05 有统计学意义。

2 结果

2.1 产前诊断结果 共计140 例孕妇接受产前诊断， 染色体微阵列分析和胎儿细胞培养染色体核型分析成功率100%，根据伴或不伴其他系统结构异常分为单纯神经系统发育异常胎儿组和复合神经系统发育异常胎儿组， 以下简称单纯组和复合组。 其中单纯组病例112 例，共检出异常染色体7例：其中18 三体2 例，染色体致病性微缺失2 例，染色体致病性微重复3 例。 同时CMA 检出6 例意义不明病例。 复合神经系统发育异常胎儿组28例，共检出异常染色体8 例：其中18 三体4 例，21三体1 例，13 三体1 例， 染色体致病性微缺失2例。 同时CMA 检出2 例意义不明病例。 见表1。

2.2 神经系统发育异常与染色体异常间关系 140例神经系统异常胎儿按异常病例结果分为单纯脉络膜囊肿3 例、单纯侧脑室增宽3 例、单纯后颅窝池增宽1 例、左侧脉络膜囊肿合并室间隔缺损，左肾重复肾1 例、右侧脉络膜囊肿合并室间隔缺损1例、双侧脉络膜囊肿合并双侧肾集合系统增宽，鼻骨骨化不全1 例、小脑蚓部稍小合并室间隔缺损1例、小脑体积稍小，左侧侧脑室增宽合并脐膨出1例、后颅窝池增宽合并室间隔缺损1 例、双侧脑室增宽合并胆囊区未见回声，室间隔缺损1 例、透明隔缺如，胼胝体发育不良合并室间隔缺损1 例。 染色体核型分析发现异常病例共10 例，染色体微阵列分析发现异常病例共15 例。 见表2。

3 讨论

目前，我国新生儿出生缺陷发生率约为5.6%，随着人口出生增加， 每年新增缺陷出生儿病例总数不断上涨[7]。 为降低先天出生缺陷的发生，世界卫生组织提出了出生缺陷的“三级预防”策略，出生缺陷的预防分为三级，其中二级预防[8]是指“早期发现、早期诊断、早期治疗”，其中早期诊断是指在胎儿出生前，通过产前筛查、产前诊断等手段对胎儿先天性缺陷进行诊断， 及早发现胎儿可能存在的先天缺陷，及早采取宫内治疗、终止妊娠等干预措施。 产前诊断[9]是妊娠期预防先天出生缺陷的重要措施，随着医疗事业的进步发展，临床产前诊断技术不断完善提高， 在诊断先天缺陷中应用广泛、效果明显，能从根本上控制出生缺陷儿数量，对提高人口素质有着重要的意义[10]。

表1 产前诊断结果

表2 神经系统发育异常与染色体异常间关系

本研究对超声提示神经系统发育异常， 伴或不伴其他系统结构异常的胎儿进行产前诊断，同时运用染色体微阵列分析技术和传统G-显带染色体核型分析技术。 研究结果显示染色体核型分析发现10 例异常核型， 染色体异常的检出率为7.1%，染色体微阵列分析发现15 例异常核型，染色体异常的检出率为10.7%，较染色体核型分析另检出5 例致病性CNVs 胎儿样本， 包括3 例B 超提示胎儿双侧侧脑室增宽，1 例B 超提示胎儿后颅窝池增宽，1 例B 超提示胎儿双侧脑室增宽合并胆囊区未见回声、室间隔缺损，染色体致病性拷贝数变异片段大小不等，均未能被传统G-显带染色体核型分析技术识别。因此，CMA 技术可以一定程度上弥补传统G-显带染色体核型分析的不足，能够更好的提高神经系统胎儿染色体异常的检出率。

传统G 显带染色体核型分析仅能检出5～10 Mb 以上的异常。 而染色体微阵列分析可识别约400 Kb 左右的不平衡拷贝数变异。研究表明，在胎儿超声结构异常而染色体核型分析结果正常的病例中，6%被检出染色体致病性拷贝数变异，而在胎儿超声和染色体核型分析结果都正常的病例中，1.7% 被检出染色体拷贝数变异[11]，CMA 与传统染色体核型分析相比，可发现更多异常病例[12]，因此，CMA 被美国妇产科协会等广泛推荐用于诊断胎儿心脏结构异常、神经系统发育异常如颅脑畸形等[13-15]。 本研究显示，1 例B 超提示胎儿单纯后颅窝池增宽[16]，染色体分析核型结果提示正常，而CMA 结果提示Xp22.2 存在640.49Kb 重复，如此小片段的致病性CNVs 并不能被传统染色体核型分析所识别，因此，临床应用中，CMA 更能深入了解胎儿异常的遗传背景，提供更有临床意义的遗传咨询。

CNVs 即拷贝数变异，现阶段常用的检测方法为染色体微阵列或CNV 测序，DNA 拷贝数有异常，也并不表明该个体表型有异常，根据2019 年美国医学遗传学学会[17]对结构拷贝数变异的解释，结合多方面的评分体系：⑴引入了定量的、基于证据的评分框架； ⑵实施广泛用于序列变异分类的五级分类系统； ⑶将基于证据的变异分类与对特定个体的潜在影响进行分离。 由于拷贝数缺失和拷贝数重复之间的显著特性和固有差异,因此针对两种拷贝数变异制定了单独的评分标准,每个计分的证据类别都被标出（1A，1B 等）以便于参考。 对CNVs 的结果分成五类: 致病性 （P）、 可能致病（LP）、不确定临床意义（VUS）、可能是良性的、良性（LB）。 其中致病性CNVs 包括：⑴与多个同行评审出版物报道具有一致临床表型的CNVs，即使存在外显不全和可变表达，但其外显和表达证据充分；⑵与已知的剂量敏感区完全重叠的独特CNVs；⑶多基因CNVs，其中已知至少一个基因具有剂量敏感性，即使其他基因的意义不确定。

本研究有1 例病例产前胎儿彩超提示单纯侧脑室增宽，CMA 结果提示6q27 区段2.3Mb 的缺失， 该区段包含THBS2、PHF10、TCTE3、WDR27、C6orf70、DLL1 基因等,根据ACMG 判读指南，该缺失判读为致病性变异。 有文献报道报道，在12 名患者中均检出6q27 区域缺失一个拷贝，且缺失区域均覆盖大小为1.2Mb 的热点缺失区域， 该区域包 含 THBS2、 PHF10、TCTE3、DLL1、WDR27 和C6orf70 基因。 患者的主要临床表现包括脑发育异常、脑室周围结节状异位、胼胝体发育不全、空洞脑、小脑发育不全、多小脑回等[18]。 另据Peddibhotla 报道，在7 例患者中均检出6q27 区域的缺失一个拷贝， 且缺失区域均覆盖大小为1.7Mb 的热点缺失区域， 该区域包含THBS2、PHF10、DLL1 和C6orf70 基因。 所有患者均表现为脑结构异常[19]。

140 例神经系统发育异常胎儿的孕妇中，单纯神经系统发育异常胎儿组112 例： CMA 检出6 例意义不明病例， 检出率5.4%（6/112）。 复合神经系统发育异常胎儿组28 例： CMA 检出2 例意义不明病例，检出率7.1%（2/28）。 随着CMA 技术的发展进步，分辨率、检出率随之增加，因此临床意义不明确的CNVs 的检出率也随之提高。意义不明病例不仅增加了产前门诊咨询的难度， 也使孕妇及其家属产生焦虑情绪， 医生并不能明确告知患者胎儿的预后。 目前不同国家的学术指南对于CMA临床意义不明结果的报道和解释存在尚争议[20]。我国针对此情况主要是通过采取父母外周血行CMA比对，协助解释不明确CNVs 的性质，从而降低临床意义不明确的CNVs 的检出率。

本研究通过探讨分析染色体微阵列分析技术(CMA)在神经系统发育异常胎儿中的应用，发现与传统染色体核型分析相比较， 染色体微阵列分析技术在异常胎儿的产前诊断中，检出率明显提高。但本研究的研究样本较小， 对胎儿神经系统发育异常产前诊断的临床价值仍需作进一步的深入研究。