固相萃取-高效液相色谱法测定卤菜中的蒂巴因

陈伟，乔勇升，胡慧

泰州市食品药品检验所（泰州 225300）

蒂巴因是罂粟植物中的一种生物碱，有一定的药用价值，也是一些药物合成中的重要中间体，其中罂粟壳中就含有的这类生物碱[1]。蒂巴因不仅会导致人失眠或者嗜睡，引起心理上某种程度的惬意和愉悦感，还会导致人注意力、记忆和思维各方面身体性能的衰退，如果长期食用还会引起精神紊乱，神经失常，使神经和消化系统受到损害，造成内分泌失调最终成瘾，严重时甚至会致人窒息和死亡[2-4]。我国对于罂粟壳的使用有明确的法律规定，严禁非法使用。有的不法商贩利用罂粟壳能使人成瘾，在食品中尤其是卤菜、火锅等食物的汤辅料中进行罂粟壳及其水浸物的非法添加，使消费者成瘾，以此来吸引更多的顾客，从中牟取暴利，极大地危害人民群众的身体健康。因此，能快速、准确、高效地检测出卤菜类食品中是否非法添加罂粟壳，是否含蒂巴因等生物碱含量，可以为执法机构提供有力的技术支持，具有很大的社会价值。

目前，蒂巴因的检测研究方法并不多，参照相关文献[5-9]中罂粟碱类物质的检测研究方法，并结合蒂巴因物质本事的特点，选择液相色谱法检测，并结合荧光检测器对含苯环类物质特有的荧光反应，应用于卤菜类食品中蒂巴因的检测，并优化检测参数，开发一种简单、快捷的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱系统（Waters 2695）；二极管阵列检测器（Waters 2625）；荧光检测器（Waters 2475）。

蒂巴因溶液标准物质（100 μg/mL，lot 228012，购于中国计量科学研究院）；甲醇、乙腈（色谱纯）；HLB固相萃取柱（Waters公司）。

1.2 色谱条件

色谱柱Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μ m）；流速1.0 mL/min；进样量20 μL；柱温30 ℃；荧光检测器，发射波长477 nm，激发波长333 nm；二极管阵列检测器，检测波长284 nm。

1.3 试验方法

1.3.1 检测器的选择对蒂巴因色谱行为的影响

蒂巴因的检测一般都可以用二极管阵列检测器和荧光检测器这两种检测器来检测，试验对两种检测器分析比较，选择较合适检测蒂巴因的检测器。

1.3.2 不同流动相体系对蒂巴因色谱行为的影响

参考文献[10-12]，蒂巴因属于极性化合物，因此流动相以水和乙腈作为基础溶剂。为了促进样品的离子化，试验比较了流动相中加入三乙胺对蒂巴因分离效果的影响。分别考察不同浓度的三乙胺水溶液以及不同的流动相比例对蒂巴因目标峰分离度以及色谱基线的影响，确定最佳流动相体系。

1.3.3 标准曲线的制作

吸取相应体积的蒂巴因标准溶液（100 μ g/mL），用乙腈分别配制成0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL一系列标准溶液，进液相色谱仪进行分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.4 提取溶剂的选择、净化方式的比较

参考文献[13-16]，一般选用固液提取法进行提取，并选择HLB小柱进行净化富集。结合卤菜类食品的样品性质，选择体积分数20%乙腈溶液进行蒂巴因的提取，并分别比较不同料液比、洗脱液对目标物测定值的影响。

1.3.5 样品的加标回收试验

以未检出蒂巴因的卤菜为空白基质，加入蒂巴因标准溶液，使用固相萃取提取后，上机检测计算回收率。

2 结果与分析

2.1 检测器的选择对蒂巴因色谱行为的影响

如图1所示，二极管阵列检测器和荧光检测器均采用外标法定量，且目标物在两种检测器中都有响应。但是相比较二极管阵列检测器，荧光检测器的灵敏度更高，基质干扰更小，一般情况下荧光检测器比二极管阵列检测器的灵敏度高约两个数量级，同样浓度的蒂巴因溶液，在荧光检测器中得到的目标峰响应值更高，稳定性更好，所以试验选择荧光检测器进行检测。

2.2 流动相体系对蒂巴因色谱行为的影响

流动相中加入0.01%三乙胺后，流动相体系有较好的稳定性，能抑制蒂巴因色谱峰的拖尾现象，故确定采用乙腈-三乙胺体系。再比较三乙胺水溶液浓度对目标物色谱行为的影响，分别以0.02%，0.01%和0.005%三乙胺水溶液为流动相，结果显示，以0.005%三乙胺水溶液进行洗脱时，色谱峰基线发生漂移，以0.02%和0.01%三乙胺水溶液进行洗脱时色谱峰都较好，为了保护色谱柱，故选择乙腈-0.01%三乙胺水溶液为流动相。对流动相比例进行了优化考察，结果发现乙腈-0.01%三乙胺水溶液（70∶30，V/V）等度洗脱时，色谱峰基线稳，峰形好，分离度均大于1.5，不对称因子在0.95～1.05之间。

2.3 标准曲线、检出限和定量限

为了验证蒂巴因在乙腈-0.01%三乙胺水溶液（70∶30，V/V）流动相体系中的线性关系，配制了蒂巴因质量浓度分别为0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列标准溶液。结果表明，蒂巴因在0.5～50.0 μg/mL内均具有良好的线性关系（r2＞0.99），具体见表1。

图1 二极管阵列检测器（a）和荧光检测器（b）对蒂巴因色谱图的影响

表1 蒂巴因的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限

2.4 前处理条件的优化

2.4.1 提取溶剂的选择

称取2.0 g样品与20%乙腈提取液，分别按料液比1∶2，1∶5，1∶10，1∶15和1∶20（g/mL）混合，超声提取30 min后，在上述优化好的仪器条件下测定，以加标回收率为比较依据。

如图2所示，当料液比为1∶5和1∶10（g/mL）时，蒂巴因的测定回收率明显高于1∶2，1∶15和1∶20（g/mL）时的含量。溶剂过少，两相浓度梯度小，蒂巴因不能被完全溶出。随着料液比的增大，两相浓度梯度增大，蒂巴因逐渐被溶出，回收率不断增加；当料液比为1∶5（g/mL）时，蒂巴因的测定值最高，且误差线较小。当料液比达到1∶10（g/mL）时，进一步增加溶剂的量，可能会溶解更多样品中的其他的物质，妨碍蒂巴因的提取分离，导致蒂巴因的含量下降。而溶剂过多导致提取液浓度较低，不利于后续HPLC检测，增大测定结果的误差，同时也会造成资源浪费，所以料液比选用1∶5（g/mL）。

2.4.2 洗脱液的选择

试验选用HLB固相萃取小柱对蒂巴因进行净化和富集。在对小柱的洗脱液方面，分别比较了超纯水及体积分数25%，50%，75%和100%甲醇溶液的洗脱效果，结果以回收率为比较依据。

如图3所示，当甲醇体积分数为25%时，蒂巴因的回收率较高，此时25%甲醇的溶液洗脱能力较强，能较完全地洗脱目标物，所以试验选择体积分数为25%的甲醇溶液作为样品的洗脱液。

图2 不同比例提取液对蒂巴因的回收率的影响

图3 洗脱液对蒂巴因回收率的影响

2.4.3 洗脱液体积的选择

在上述选用25%甲醇作为HLB固相萃取小柱洗脱液的基础上，比较了洗脱液体积对蒂巴因回收率的影响。分别比较了超纯水1，2，3，4和5 mL 5种体积对蒂巴因目标物洗脱效果的影响。

如图4所示，随着洗脱液体积不断增加，蒂巴因的回收率逐渐升高，但洗脱液体积达到3 mL以后再增加洗脱剂体积，蒂巴因回收率并没有明显增加，此时HLB固相萃取小柱中的目标物较完全地被洗脱出，再增加洗脱液体积对蒂巴因的回收率影响不大，所以选择3 mL为洗脱体积较合适。

图4 洗脱液体积对蒂巴因回收率的影响

2.5 加标回收与阳性样品

分别添加1.0，10.0和50.0 μg/kg共3个梯度浓度的蒂巴因标准溶液，进行加标回收试验，每个浓度重复测定5次，结果见表2。蒂巴因的加标回收率范围为91.5%～94.2%，相对标准偏差（RSD）为3.1%～6.8%，表明试验所建立的检测蒂巴因的方法具有可靠的准确度和精密度。图5为阳性样品的色谱图。

表2 方法的回收率及相对标准偏差（n=5） %

图5 阳性样品的色谱图

3 结论

试验建立了一种固相萃取-高效液相色谱法检测食品中蒂巴因的分析方法。该方法的准确度和精密度是可行的，前处理选择用的固相萃取可以缩短前处理时间，节约成本。试验结果表明，在乙腈-0.01%三乙胺水溶液（70∶30，V/V）体系中，蒂巴因得到了良好的基线分离。样品在经20%乙腈提取后，采用HLB固相萃取柱法以3 mL 25%甲醇作为洗脱溶剂，可有效去除样品中的复杂基质对目标峰的影响，实现对蒂巴因的净化与富集。样品的加标回收率在91.5%～94.2%之间，符合检测要求。