大孔树脂分离纯化茶枯饼中的茶皂素

何荣荣，陈献翔，陈海明，谭运寿，陈卫军*，钟秋平*

1. 海南大学食品学院（海口 570228）；2. 海南侯臣生物科技有限公司（澄迈 571921）

茶皂素主要来源于油茶籽榨油剩下的油茶粕，具有良好的表面活性作用和药理功能，在食品、日化、医药等领域应用十分广泛[1-6]。市售的茶皂素常因颜色深、纯度低、含有多糖和蛋白质等杂质，影响其在实际生产中的开发和利用，因此进一步分离纯化茶皂素十分必要。茶皂素的纯化方法有化学沉淀法、双水相法、膜富集法、大孔树脂法等，膜富集法对设备要求较高，成本较大；双水相法需要用到高聚物和无机盐且后续脱盐困难，不适宜大规模工业化生产[7-8]；化学沉淀法溶剂消耗大，环境污染严重。而大孔树脂法具有比表面积大、条件温和、稳定性高、选择性好、再生简单、耗能低、易于自动化、环境友好等优点[9]，弥补了传统的化学沉淀法和膜分离法的不足[10]，被广泛应用于天然产物的提取与分离。目前，关于利用大孔树脂纯化茶皂素的研究已有文献报道，但研究主要集中在对纯化工艺的探索和优化上，鲜有结合吸附动力学的报道。因此，试验以海南产茶枯饼中茶皂素的粗提物为原料，以大孔树脂X-5为吸附试材，研究其对茶皂素的吸附动力学特征和纯化条件，以期为大孔树脂分离纯化茶皂素提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶枯饼（热压法）：由海南侯臣生物科技有限公司提供。茶皂素标准品（北京索莱宝科技有限公司）；大孔树脂（郑州勤实科技有限公司）；乙醇、浓硫酸（广州化学试剂厂）；香兰素（国药集团化学试剂有限公司）；除标准品外其余均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-4型数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；XX型粉碎机（永康市小宝电器有限公司）；TU-1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；T6型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；Christ Alpha1型冻干机（德国Christ公司）；SHA-2型恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 茶皂素定量分析

称取20 mg茶皂素标品，用80%乙醇溶解，配置成质量浓度为0.4 mg/mL的母液，按照李静等[11]的方法光谱扫描得出最大吸收波长468 nm。

分别吸取0.05，0.15，0.25，0.35和0.45 mL上述标准溶液，相同的步骤，得出标准曲线方程：y=18.712x+0.035 8，R2=0.999 9。

1.3.2 茶皂素粗品的制备

用研钵将茶枯饼初步捣碎，然后经中药粉碎机粉碎，过60目筛后置于干燥器中备用。准确称取一定量的茶饼粉，加入67%乙醇，料液比为1∶17（g/mL），于178 W超声辅助提取36 min，过滤，氮气吹干乙醇，冷冻干燥后置于密封袋中保存备用。

1.3.3 大孔树脂的预处理[12]

取一定量的树脂，加入蒸馏水，浸泡24 h，经蒸馏水反复冲洗后，用95%乙醇浸泡72 h以除去醇溶物，再分别用5%的盐酸和5%的NaOH溶液浸泡24 h，用蒸馏水洗至中性，备用。

1.3.4 静态吸附实验

称取0.5 g茶皂素粗品，定容至50 mL。准确称取3 g预处理后的湿树脂于150 mL锥形瓶中，加入50 mL茶皂素溶液，分别置于30，40和50 ℃的恒温摇床中，在150 r/min的条件下进行振荡吸附，每间隔10 min取样，测定上清液中茶皂素的浓度，直到吸附平衡。按式（1）和（2）计算吸附量（qe）和吸附率（E）。

式中：qe表示平衡吸附量，mg/g；C0表示茶皂素的初始质量浓度，mg/mL；Ce表示茶皂素吸附平衡时的浓度，mg/mL；Vi表示茶皂素浓缩液的体积，mL；W表示树脂的质量，g；E表示吸附率，%。

大孔树脂吸附茶皂素的动力学模型有一级动力学模型、二级动力学模型和颗粒扩散动力学模型。采用上述3种模型来描述吸附过程，模型如式（3）、（4）和（5）所示[13]：

式中：qe表示平衡吸附量，mg/g；qt表示t时刻的吸附量，mg/g；K1表示准一级动力学速率常数，min-1；K2表示准二级动力学速率常数，g/（mg·min）；Kd表示颗粒扩散动力学速率常数，mg/（g·min0.5）；C为常数。

1.3.5 吸附等温线

准确称取3 g预处理后的湿树脂X-5于150 mL锥形瓶中，分别称取0.1，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8和2.1 g茶皂素并定容至50 mL，依次加入150 mL锥形瓶中，于不同温度（20，30，40和50 ℃）的摇床中振荡，测定平衡时的茶皂素质量浓度，建立吸附等温线。

采用Langmuir模型和Langmuir模型来描述吸附平衡[14-17]，公式如（6）和（7）所示：

式中：Ce表示吸附平衡时的茶皂素质量浓度，mg/mL；qm表示最大吸附量，mg/g；qe表示平衡吸附量，mg/g；KL表示Langmuir常数，mL/mg；KF表示Freundlich常数，[（mg/g）·（mL/mg）]1/n；n为表示吸附能力的表观常数。

1.3.6 动态吸附与解析

1.3.6.1 X-5大孔树脂的装柱

将已处理好的树脂湿法装入固定好的玻璃层析柱中（Φ 30 mm×300 mm），柱体积为60 mL，待树脂自然沉降后，先用80%乙醇清洗柱子约1个柱体积，再用去离子水洗至流出液呈无色，清洗时确保柱内液面与树脂表面的高度差保持在2 cm以上[18]。

1.3.6.2 上样量的筛选

将体积为210 mL的茶皂素溶液以流速为1 mL/min的流速上柱，每10 mL收集一管，测定每管中茶皂素的浓度，绘制茶皂素泄漏曲线，确定茶皂素最大上样量。

1.3.6.3 上样流速的筛选

通过调整恒流泵的转速，使上样流速分别为0.5，1，1.5和2 mL/min，一边上样一边收集下端的流出液，每0.5个柱体积（BV）收集一管，测定其中茶皂素浓度，确定最佳上样流速。

1.3.6.4 洗脱梯度筛选

分别采用蒸馏水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇依次洗脱，控制洗脱流速为1 mL/min，每个梯度洗脱3 BV，收集各梯度的洗脱液并计算解析率，确定最佳的洗脱梯度。

1.3.6.5 洗脱流速的筛选

调整恒流泵的转速，使洗脱液流速分别为1，2和3 mL/min，依次使用蒸馏水、40%乙醇、80%乙醇进行洗脱，每个梯度洗脱3 BV，每0.5个柱体积（BV）收集一管，测定茶皂素的浓度，确定最佳洗脱流速。

1.4 数据分析

试验数据采用DPS的单因素方差分析进行差异性分析（p＜0.05），使用Origin 2017进行方程拟合并绘图。

2 结果与分析

2.1 吸附动力学

2.1.1 吸附动力学曲线

大孔树脂X-5对茶皂素在不同温度下不同时间内的吸附量变化趋势相似（图1），在60 min之前随着吸附时间的延长，茶皂素吸附量迅速增加，为快速吸附阶段；在60～100 min之间，吸附量增加缓慢，为未饱和吸附阶段；在100 min时茶皂素吸附量基本达到吸附平衡；100 min以后为饱和吸附阶段[19]。

由表1可知，不同温度下一级动力学模型有较好的线性相关性（R2最大），其次是颗粒扩散动力学模型，说明一级动力学方程能更好描述该吸附模型，由一级动力学方程计算出的K1值在温度为50 ℃时达到最大值。

2.1.2 吸附等温线

进一步研究X-5树脂对茶皂素的吸附特性，结果如图2所示。大孔树脂X-5的平衡吸附量随茶皂素浓度的增加而增加，当平衡浓度为15.45 mg/mL时，平衡吸附量达到最大值。

图1 不同温度下大孔树脂的吸附动力学曲线

表1 大孔树脂对茶皂素的吸附动力学参数

图2 X-5树脂在不同温度条件下对茶皂素的吸附等温线

由表2可知，与Langmuir模型相比，Freundlich模型的拟合度较高，说明Freundlich方程更能准确反映该吸附过程。由Freundlich方程拟合得到的参数可知，KF随着温度的增加而增加；1/n值均在0.1～0.5之间，表明茶皂素在X-5上的吸附很容易发生[20]。

表2 大孔树脂对茶皂素的吸附等温线参数

2.2 动态吸附、洗脱条件的确定

2.2.1 上样体积和上样流速的筛选

由图3（A）可知，当上样量增加到60 mL时，茶皂素开始泄漏，因此选取60 mL作为最大上样体积。从图3（B）可知，当上样流速从0.5 mL/min增加到2 mL/min时，茶皂素泄漏得越来越快，在最大上样量之前，流速0.5 mL/min与1 mL/min时的茶皂素泄漏速度相近，综合考虑选择1 mL/min为最佳上样流速。

图3 上样体积和上样流速对纯化的影响

2.2.2 洗脱梯度和洗脱流速的筛选

由图4（A）可知，茶皂素的解析率随着乙醇体积分数的增大而增大。使用60%和80%乙醇洗脱时，解析率均在80%以上，但用60%乙醇洗脱后仍有部分茶皂素残留在树脂中，造成原料的浪费，因此考虑采用的洗脱梯度：蒸馏水→40%乙醇→80%乙醇。由图4（B）可知，当洗脱流速为1 mL/min时，洗脱峰基本可以分离，峰型尖锐，对称性良好且无拖尾现象。当洗脱流速增大时，洗脱峰开始变宽，流速为3 mL/min甚至出现了拖尾的现象。而流速2 mL/min的洗脱峰型与1 mL/min的峰型相近。综合考虑，选择洗脱流速2 mL/min为最佳洗脱流速。

图4 洗脱梯度和洗脱流速对纯化的影响

3 结论

此次试验研究表明：大孔树脂X-5动态吸附的最佳条件为上样浓度15.45 mg/mL、上样量60 mL、上样流mL/min；最佳洗脱条件为依次用蒸馏水、40%乙醇、80%乙醇进行洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，洗脱流速2 mL/min，在此条件下茶皂素纯度可以达到85.40%左右（纯化前为27.68%），回收率可达77.13%。通过对X-5树脂纯化茶皂素动力学的研究发现，X-5树脂对茶皂素的吸附更符合一级动力学模型。Freundlich方程能较好地拟合X-5对茶皂素的吸附过程。此次研究所得到茶皂素纯度还有进一步提升的空间，因此对茶皂素进行单体分离、纯化及分子鉴定，将是后续研究的重要内容。