基于多重数据库的肾癌转移相关基因生物信息分析及功能初探

张金虎，周洋，王诚悦，邹元章，汪浩洋，卢俅，孙浩

(江苏大学附属医院泌尿外科，江苏 镇江 212013)

肾细胞癌是一种起源于肾上皮的癌症，占所有肾恶性肿瘤的90%以上[1]。肾癌对放疗和化疗均不敏感，对于早期肾癌，手术切除肿瘤是目前治疗局限性肾癌最有效的方法，但是有近1/3肾癌患者在确诊时已经发生远处转移，即使接受了手术治疗，仍有30%患者出现肿瘤复发或转移[2]。肾癌转移的基础机制仍然不完全清楚。生物信息学可帮助研究者快速、大量和高效地获取基因组信息和基因表达谱改变等。本研究拟通过生物信息学技术，探讨肾癌转移瘤及原发性肾癌基因表达的差异，找出关键的差异基因及其潜在的分子调控机制，并预测其所涉及的功能。

1 材料与方法

1.1 材料

微阵列数据Gene Expression Omnibus(GEO，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)是数据存储的公共存储库，选取GSE85258芯片数据集，该芯片包含16例肾癌转移瘤患者血样品和15例原发性肾癌患者血样品。肾癌769-P细胞株(美国ATCC细胞公司)；RPMI 1640培养基、细胞培养皿购自生工生物工程(上海)股份有限公司；胎牛血清、Lipofectamine 2000试剂盒(美国Thermo公司)；siRNA-表面活性蛋白A2(SFTPA2)、siRNA-空购于吉玛基因公司(上海)；侵袭小室(直径6.5 mm，厚8.0 μm)购于南京福麦斯生物技术有限公司；细胞培养箱(HeraceⅡ 150i)、倒置显微镜(conic)、荧光正置显微镜(BX51)等由江苏大学附属医院中心实验室提供。

1.2 在线数据库分析

1.2.1 登录网站 登录GCBI(http:∥www.gcbi.com.cn/)网站，注册账号，点击分析实验室，创建实验室。

1.2.2 选择需要的模块 本研究选择样本分组1、样本分组2、差异分析、生物功能(GO)分析、信号通路(Pathway)分析、交集、基因相互作用、共表达、通路关系9个模块。

1.2.3 设置模块参数 差异分析(P<0.05，差异倍数>1.2倍，数量3 000)；GO分析、Pathway分析(P<0.05)。

1.2.3 设计流程图应用箭头将上述模块按照(样本分组1、样本分组2)—差异分析—(GO分析、Pathway分析)—交集—(基因相互作用、共表达)连接起来，使之成为一套完整的流程。

1.2.4 数据库在线分析 将16例实验组数据引入样本分组1，15例对照组数据引入样本分组2。点击分析，约30 min分析完毕，查看分析结果。

1.3 细胞实验

1.3.1 细胞培养及分组 将肾癌769-P细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置5%CO237℃恒温箱中培养，24 h换液1次，当细胞长到80%～90%进行消化传代。细胞分2组：转染siRNA-SFTPA2抑制769-P细胞表达SFTPA2作为实验组，转染siRNA-空不抑制769-P表达SFTPA2作为对照组。

1.3.2 细胞转染 取对数生长期769-P细胞株，以2×105/mL密度接种于6孔板，培养过夜；细胞饥饿2 h，按照Lipofectamine 2000说明书将siRNA-SFTPA2和siRNA-空分别加入到769-P细胞培养皿中；次日换为普通培养基。

1.3.3 细胞侵袭实验 消化转染后的细胞，2 500 r/min常温离心4 min，取细胞沉淀。用无胎牛血清RPMI 1640培养基重悬细胞，计数板显微镜下计数。取10 000个细胞，上室中加入500 μL无胎牛血清RPMI 1640培养基，下室加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，放置5%CO237 ℃培养箱中培养24 h；甲醇固定小室下室面细胞；结晶紫染色30 min；用PBS将小室洗净；晾干小室；用荧光正置显微镜(100倍)观察两组小室下室面细胞，各选取5个不同视野计数细胞。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 人肾癌转移瘤和人原发性肾癌差异基因的筛选结果

将筛选出的3 000个差异基因按差异倍数和q值进行排序并选出差异最大的10个升高基因(表1)和10个降低基因(表2)。SFTPA2升高最显著，溶质载体家族17成员3(SLC17A3)降低最明显。

2.2 GO分析和Pathway分析结果

GO分析发现，3 000个差异基因与350个生物功能有关，选10个最显著的生物功能(表3)。Pathway分析结果显示，3 000个差异基因与128条信号通路有关，挑出10条最显著的信号通路(表4)。

表1 升高显著的差异基因

表2 降低显著的差异基因

表3 差异基因GO分析

表4 差异基因Pathway分析

2.3 差异基因间相互作用结果

筛选3 000个差异基因中与上述350个生物功能有关且与128条信号通路有关的基因，得到523个基因。构建基因网络，发现523个差异基因中存在441条相互作用关系，有260个节点。选取信号传递中介能力最大的10个基因作图。结果丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)的信号传递中介能力最大，其可能是基因网络的中心环节，且与蛋白激酶C(PRKCA)、原癌基因(NRAS)、一氧化氮合酶1(NOS1)存在直接联系(图1)。

2.4 差异基因共表达结果

研究发现，523个差异基因中存在571条共表达关系，共有169个节点，其中有正相关也有负相关，选取10个与周围基因关系数量最多的基因构图，发现10个基因间共表达互为正相关(图2)。

箭头方向表示上下游，无箭头表示两个基因形成复合物发挥协同作用，实线表示直接作用，虚线表示间接作用

图1 差异基因间相互作用

实线表示正相关

2.5 信号通路网络分析结果

将与3 000个差异基因有关的128条信号通路作网络分析，结果显示，其中存在156条关系，有54个节点。选取10个上下游通路最多的信号通路，发现MAPK信号通路为上下游通路最多的信号通路，其可能是这些差异基因的核心信号通路(图3)。

箭头方向表示上下游

2.6 侵袭实验结果

细胞侵袭实验结果显示，实验组肾癌细胞侵袭细胞数明显小于对照组(t=18.44，P<0.01)，由此可以初步认为抑制肾癌769-P细胞SFTPA2表达可降低其侵袭能力(图4)。

图4 侵袭实验结果

3 讨论

在GSE85258数据集中对实验组与对照组进行差异基因筛选，共得到3 000个差异基因。既往研究认为SFTPA2和纤维化及第三类致死率较高的遗传性肺纤维化有相关性，研究表明SFTPA2与肾纤维化也有关[3]。此外，有研究发现SFTPA2 参与编码人表面活性蛋白[4]，可能与肺癌有关[5]。本研究发现的差异基因中，SFTPA2升高最明显，提示SFTPA2高表达可能对肾癌的转移和进展起关键作用。

本研究发现差异基因GO分析最显著的生物功能是依赖DNA转录，Pathway分析最显著的是内质网蛋白质加工，因此可初步认为差异基因可能通过影响依赖DNA转录和内质网蛋白质加工，从而影响肾癌的转移。而差异基因共表达网络图中基因之间的表达有正相关也有负相关，故基因间具体的表达关系及对肾癌发生转移的影响，尚需进一步研究。

在构建基因网络中，发现MAPK1信号传递中介能力最大，且其与PRKCA、NRAS、NOS1存在直接联系。研究显示，MAPK1是调控胃癌细胞增殖和迁移的直接功能靶点[6]。另有研究发现MAPK1与肝内胆管癌、肝细胞癌有关[7-8]。Guo等[9]发现，PRKCA与食管炎的恶变呈正相关；Zhu等[10]发现，NOS1抑制鼻咽癌细胞的自噬。因此，MAPK1、PRKCA、NOS1与肿瘤的发生发展存在相关性。且目前尚不能排除NRAS与肿瘤无关。故推断，MAPK1、PRKCA、NRAS、NOS1异常表达可能与肾癌发生转移存在一定的相关性。

信号通路网络分析发现，MAPK信号通路是上下游通路最多的信号通路。研究表明有基因通过靶向MAPK信号通路增强肾癌细胞活力、侵袭性和进展[11-13]。在MAPK信号通路上下游中，包含细胞周期、细胞凋亡、P53信号通路、癌症途径等与肿瘤发生发展密切相关的信号通路。因此推断，上述通路与肾癌转移具有相关性。

选取表达差异最显著的基因行体外细胞实验，结果显示抑制SFTPA2表达可降低肾癌细胞侵袭能力。由此可初步推测SFTPA2异常表达与肾癌转移有一定的关系。但本研究只进行了细胞侵袭实验，细胞增殖实验和细胞凋亡实验及其他相关实验待后续完善，以期进一步了解SFTPA2在肾癌细胞中的功能。

综上所述，本研究在肾癌转移瘤患者血中发现3 000个差异基因，表达异常的基因可能通过复杂的基因调控网络，参与MAPK信号通路等，促进肾癌发生转移。