CXCL12-CXCR4轴促进胶质母细胞瘤前神经-间质转化

许学文，宋廉，杨晓晓，石卉，龚爱华，王鸣，张礼荣

(1.江苏大学附属医院影像科，江苏 镇江 212001；2.江苏大学医学院，江苏 镇江 212013)

胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)是成人最常见的原发性脑肿瘤，中位生存期为12～15个月，5年生存期低于5%[1]。尽管GBM的放疗、化疗及其他辅助治疗对改善患者的生存期具有一定的效果，但其复发率仍然较高[2]。当前基于基因表达图谱将GBM分为4个亚型：前神经型(33%)、神经型(12%)、经典型(20%)及间质型(32%)[3]；其中间质型具有恶性程度高、预后差的特点，且前神经型具有间质型转化的特征，即前神经型-间质型转化(proneural-mesenchymal transition, PMT)[4]，然而其确切的分子机制仍不是十分清楚。

趋化因子及其受体在胶质瘤发生、发展中的机制已成为目前研究的热点[5]。CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)属于趋化因子受体CXCR亚家族，CXC趋化因子配体-12(CXC chemokine ligand 12，CXCL12)是其唯一配体，CXCL12-CXCR4轴在促进干细胞归巢、诱导血管生成及肿瘤侵袭转移等方面具有重要的作用[6]。但是，CXCL12-CXCR4轴在胶质瘤中的作用尚不完全清楚，本研究拟探讨CXCL12-CXCR4轴在胶质母细胞瘤PMT中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人胶质瘤LN428，U87MG细胞株(中国科学院上海生命科学研究院)；CXCL12(美国Genscript公司)；普乐沙福(美国 MedChem Express公司)；高糖DMEM、PBS(美国Hyclone公司)；澳洲胎牛血清(美国Gibco公司)；兔单克隆抗体N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、几丁质酶-3样蛋白-1(chtinase-3-like-1 protein，CHI3L1/YKL-40)、波形蛋白、β-微管蛋白(美国Cell Signaling Technology公司)；鼠单克隆抗体少突胶质细胞转录因子2(oligodendrocyte lineage transcription factor 2，OLIG2)，羊抗兔二抗，羊抗鼠二抗(美国Santa Cruz公司)；基质胶、Transwell小室(美国Corning Incorporated公司)；ECL发光液(美国Millipore公司)；牛血清白蛋白(德国 BioFroxx公司)；CCK8试剂盒(日本Dojindo公司)。

1.2 细胞培养

人胶质瘤LN428、U87MG细胞株均培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM，置于37℃、5%CO2培养箱中，细胞生长至80%～90%融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3 免疫印迹实验检测细胞前神经型和间质型相关蛋白

1.3.1 选择CXCL12在细胞中最佳作用浓度 取对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化重悬，接种入6孔板，每孔培养基补足至2 mL，于37℃、5%CO2培养箱中观察；次日细胞贴壁后，观察细胞状态良好，细胞接种密度为60%～70%；将细胞分为CXCL12不同浓度(0、20、40、60、80、100 ng/mL)处理组，共培养48 h后收集各组细胞；预冷PBS清洗，立即加入蛋白裂解液提取总蛋白，100℃煮沸10 min；4 ℃行12 000×g离心10 min，上清液即为蛋白样品。以每个泳道20 μg蛋白样品上样，行10%变性SDS-PAGE；将蛋白转移至PVDF膜；5%牛血清白蛋白室温封闭30 min；加入一抗4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min；加入二抗室温摇床孵育1 h；TBST洗膜3次，每次5 min；ECL 发光试剂显影，在凝胶成像系统上曝光并使用Image J软件对蛋白条带进行定量分析，与内参β-微管蛋白比较。一抗N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、波形蛋白、YKL-40、β-微管蛋白稀释比均为1 ∶1 000、一抗OLIG2的稀释比为1 ∶500；二抗稀释比均为1 ∶10 000。每组实验独立重复3次。根据蛋白表达量选择CXCL12最佳作用浓度。

1.3.2 检测普乐沙福对细胞前神经型和间质型相关蛋白的影响 将细胞分为对照组，CXCL12组，普乐沙福组，CXCL12+普乐沙福组，分别予以PBS，80 ng/mL CXCL12，20 μmol/L普乐沙福，80 ng/mL CXCL12+20 μmol/L普乐沙福处理。采用免疫印迹法检测相关蛋白的表达。具体实验操作方法同“1.3.1”。每组实验独立重复3次。

1.4 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力

取对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化重悬，接种入6孔板，每孔培养基补足至2 mL，于37℃、5%CO2培养箱中培养；次日细胞贴壁后，观察细胞状态良好，细胞接种密度为60%～70%。将细胞分为对照组，CXCL12组，CXCL12+普乐沙福组，分别予以PBS, 80 ng/mL CXCL12，80 ng/mL CXCL12+20 μmol/L普乐沙福处理。共培养48 h后收集各组细胞。在侵袭实验前，小室上层铺100 μL 1 ∶20稀释的基质胶，置于细胞培养箱，待胶凝固后备用。迁移实验无须铺胶。将3×104个胶质瘤细胞用100 μL无血清高糖DMEM重悬置于小室上层，小室下层加入500 μL含10%胎牛血清的高糖DMEM。将小室置于37℃、5%CO2培养箱中培养14 h；4%低聚甲醛固定30 min；用棉签轻轻拭去小室内面细胞；用0.1%结晶紫染色液浸染30 min，风干后置于显微镜下观察并拍照；运用Image J软件计算穿膜细胞数。每组实验独立重复3次。

1.5 CCK8法检测细胞增殖率

制得单细胞悬液，以1 000个/孔密度接种于96孔板；次日细胞贴壁后，实验分组同“1.4”，同时设空白组(只含DMEM)进行校正，每组设3个复孔。按说明书要求，每天加入10 μL CCK8试剂，放置培养箱中孵育2 h，用酶标仪测定450 nm处的光密度值。以培养时间为横轴，相对增殖率为纵轴，绘制细胞生长曲线。每组实验独立重复3次。

1.6 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

取对数生长期细胞，制备单细胞悬浮液，并以1 000个/孔密度接种于6孔板，每孔加入2 mL培养基，待细胞贴壁后，实验分组同“1.4”。每隔3至4天半换液1次，静置培养2～3周；当出现肉眼可见克隆时，终止培养；4%低聚甲醛固定30 min；0.1%结晶紫染色30 min；拍照并计算克隆数。每组实验独立重复3次。

1.7 生物信息学分析

通过Cancer Brower下载TCGA中胶质瘤患者的mRNA表达及临床相关数据，分析CXCR4 mRNA在健康者与患者以及在GBM患者不同亚型中的表达水平，进一步分析CXCR4 mRNA与CXCL12、N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、波形蛋白、YKL-40、OLIG2 mRNA的相关性。以平均值为界，将高于和低于平均值分别定义为高表达组和低表达组。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 CXCR4在胶质瘤中的表达及病理分析

TCGA-GBM(AffyU133a)数据库样本共539例，其中健康者脑组织样本10例，脑胶质瘤组织样本529例(前神经型139例，间质型158例，经典型145例，神经型87例)。与健康者脑组织相比，脑胶质瘤组织中CXCR4 mRNA表达水平显著增高(t=7.346，P<0.01)；CXCR4高表达组(n=262)胶质瘤患者总体生存率明显低于低表达组(n=262，χ2=5.056，P<0.05)；CXCR4 mRNA在前神经型中表达明显低于间质型(t=10.53，P<0.01)。基因表达热图分析表明，CXCR4 mRNA与CXCL12、N-钙黏蛋白、波形蛋白、YKL-40 mRNA成正相关，与E-钙黏蛋白、OLIG2 mRNA成负相关。见图1。

2.2 选择CXCL12在胶质瘤细胞中最佳作用浓度

免疫印迹实验结果显示，不同浓度CXCL12(0、20、40、60、80、100 ng/mL)预处理后，与0 ng/mL相比，80 ng/mL CXCL12处理后细胞内OLIG2(LN428：t=14.62，U87MG：t=8.46，P均<0.05)、E-钙黏蛋白(LN428：t=18.03，U87MG：t=6.27，P均<0.05)的表达显著降低，YKL-40(LN428：t=11.02，U87MG：t=11.57，P均<0.01)、N-钙黏蛋白(LN428：t=5.83，U87MG：t=12.79，P均<0.05)、波形蛋白(LN428：t=5.30，U87MG：t=10.58，P均<0.05)的表达显著增高。综合考虑，选择80 ng/mL CXCL12作为最佳实验浓度进行后续实验。见图2。

图1 TCGA胶质瘤(AffyU133a)数据库分析CXCR4 mRNA在胶质瘤中的表达

a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组比较

2.3 CXCL12-CXCR4轴促进胶质瘤细胞PMT

免疫印迹实验结果显示，胶质瘤细胞经80 ng/mL CXCL12处理后，OLIG2蛋白表达水平较对照组显著降低(LN428：t=5.66，U87MG：t=12.53，P均<0.05)，YKL-40蛋白表达水平较对照组显著上升(LN428：t=8.66，U87MG：t=15.30，P均<0.01)；而经20 μmol/L普乐沙福和80 ng/mL CXCL12+20 μmol/L普乐沙福分别处理后，与CXCL12组对比，OLIG2蛋白表达水平显著升高(LN428：t=13.98，9.82，U87MG：t=16.42，10.73，P均<0.01)，YKL-40蛋白表达水平显著降低(LN428：t=22.52，24.45，U87MG：t=16.38，18.40，P均<0.01)。见图3。

2.4 CXCL12-CXCR4轴促进胶质瘤细胞侵袭和迁移

Transwell结果显示，80 ng/mL CXCL12预处理48 h后，胶质瘤细胞迁移(LN428：t=11.46，U87MG：t=16.52，P均<0.01)和侵袭(LN428：t=6.03，U87MG：t=10.05，P均<0.01)数量显著多于对照组；给予普乐沙福处理后，与单纯 CXCL12组比较，细胞迁移(LN428：t=9.22，U87MG：t=11.42，P均<0.01)和侵袭(LN428：t=5.37，U87MG：t=8.53，P均<0.01)数量则显著降低。见图4。

a：P<0.05，b：P<0.01

a：P<0.01

2.5 CXCL12-CXCR4轴促进胶质瘤细胞增殖

克隆形成实验显示，与对照组相比，胶质瘤LN428细胞CXCL12组形成的克隆数显著增多(t=28.46，P<0.01)，加入普乐沙福后，细胞克隆数显著减少(t=35.10，P<0.01)。由于胶质瘤U87MG细胞株弥漫性生长方式导致细胞的克隆不明显，与对照组相比，CXCL12组细胞克隆数显著增多(t=10.50，P<0.01)，加普乐沙福后，细胞克隆数显著降低(t=16.50，P<0.01)。此外，CCK8实验结果显示，与对照组相比，胶质瘤LN428和U87MG细胞CXCL12组细胞增殖率显著增高(LN428：t=8.28，U87MG：t=3.98，P均<0.01)，加入普乐沙福后，细胞增殖率显著降低(LN428：t=8.252，U87MG：t=9.60，P均<0.01)。见图5。

a：P<0.05，b：P<0.01,与对照组比较；c：P<0.05，与CXCL12+普乐沙福组比较

3 讨论

胶质瘤肿瘤细胞前神经型和间质型可以互相转换，并受周围微环境的精确调控[7]。CXCR4是一种高度保守的7次跨膜G蛋白偶联受体，首次在外周血白细胞中发现，在多种细胞类型中呈高表达，包括淋巴细胞、造血干细胞、基质成纤维细胞和癌细胞[8]。本研究结果显示，与健康者相比，胶质瘤患者CXCR4 mRNA表达增高，且与患者生存率呈负相关；基因表达热图结果显示，CXCR4 mRNA和CXCL12 mRNA与间质型指标YKL-40、N-钙黏蛋白、波形蛋白mRNA呈正相关，与前神经型指标OLIG2、E-钙黏蛋白mRNA呈负相关。由此表明，CXCL12-CXCR4轴可能与肿瘤恶性生物学行为有关。但是，CXCL12-CXCR4轴是否参与胶质瘤其他生物学行为，如PMT、增殖、转移等，还需进一步研究。

研究发现，PMT是胶质母细胞瘤局部浸润和转移的关键因素[9]；另有研究表明，胶质瘤细胞从前神经型向间质型的转化过程中，YKL-40的升高和OLIG2的降低代表细胞向间质型转化[10]。本研究结果显示，在胶质瘤LN428和U87MG细胞中加入外源性CXCL12后，YKL-40蛋白表达显著升高，OLIG2蛋白显著降低，且细胞的侵袭、迁移能力显著增高。由此表明，CXCL12-CXCR4轴可以促进胶质瘤细胞PMT，从而增强胶质瘤局部浸润和远处转移。在抑制CXCL12-CXCR4信号传导的药物中，选择性CXCR4拮抗剂普乐沙福是研究最多、临床应用最广的化合物[11]。本研究结果显示，予以普乐沙福处理后，胶质瘤LN428和U87MG细胞的间质型相关指标YKL-40蛋白表达显著降低，前神经型相关指标OLIG2蛋白表达显著升高，且细胞的迁移和侵袭能力显著受到抑制。由此表明，普乐沙福可以阻断CXCL12-CXCR4轴，从而抑制胶质瘤细胞PMT。

研究表明，肿瘤细胞具有无限增殖的能力，最终导致恶性肿瘤形成[12]。为了进一步验证CXCL12-CXCR4轴与胶质瘤的恶性生物学行为相关，本实验进行了克隆形成实验和CCK8法检测胶质瘤细胞的增殖能力。结果显示，予以胶质瘤LN428和U87MG细胞外源性CXCL12处理，细胞的克隆形成能力和相对增殖率显著增高；普乐沙福处理后，胶质瘤LN428和U87MG细胞的克隆形成能力和相对增殖率显著降低。由此表明，CXCL12-CXCR4轴可以提高胶质瘤细胞的增殖能力，阻断CXCL12-CXCR4轴可以降低胶质瘤细胞的增殖能力。

此外，有研究发现，CXCL12依赖性刺激肿瘤细胞上的CXCR4，从而激活包括PI3K/AKT/mTOR在内的关键下游通路，参与肿瘤的生存、增殖、转移等过程[13]；另有研究表明，在胶质瘤中PI3K/AKT/mTOR信号通路异常活化，抑制通路后可以有效地延长胶质瘤患者生存时间[14]。结合之前的研究，无论CXCL12-CXCR4轴在癌症中的确切机制如何，该轴在脑胶质瘤的发生进展过程中起着重要作用。CXCL12-CXCR4轴在胶质瘤细胞PMT过程中可能激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。

综上所述，本研究利用一定浓度的CXCL12及普乐沙福作用于体外培养的胶质瘤LN428和U87MG细胞株，表明CXCL12-CXCR4轴可以促进胶质瘤细胞PMT；普乐沙福通过阻断CXCL12-CXCR4轴，可有效抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移，具体分子机制还有待进一步研究。