菊花硫磺熏蒸前后挥发油类成分的差异性分析

孙旭杰，王慧颖，侯磊，闫舒，张菊，蒋俊

(1.江苏大学药学院，江苏 镇江 212013；2.镇江市食品药品监督检验中心，江苏 镇江 212000)

为达到漂白、防霉、防虫等目的，硫磺熏蒸后的中药在市场上广泛流通[1]。从毒理学上来说，硫磺可引起眼结膜炎、皮肤湿疹等疾病，且对皮肤有弱刺激性[2]。研究表明，硫熏工艺不仅改变了中药的化学成分[3]，也降低了中药的抗炎、抗氧化、调节免疫等多种功能[4, 5]，甚至诱发了血小板、肝脏、肾脏等多种损伤[6-10]。目前，中药的硫磺熏蒸问题已经引起了行业内的高度关注，硫熏菊花相关研究报道也屡见不鲜。

菊花为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序，能清热解毒，用于风热感冒、疮痈肿毒等[11]，其挥发油类成分含量在0.57%～4.95%[12-13]。现代研究表明，菊花挥发油对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌有抑制作用[14]，还具有抗炎[15]、降压[16]等作用。硫磺熏蒸后的菊花会造成咽喉疼痛、胃部不适等不良反应[17]。硫磺熏蒸诱导黄酮苷类化合物经水解反应转化为苷类化合物[18]；菊花经过硫熏之后因成分变化而影响其入肠吸收[19]，同时抗氧化应激作用减弱[20-21]。目前，如何快速准确地鉴别出硫熏菊花仍然是一个技术难题。2015版《中国药典》中采用酸碱滴定法检测二氧化硫残留量[22-23]，但是药材中残留的二氧化硫会随着贮藏时间不断减少,可达50%[24]。本研究以菊花为例，探究其硫熏前后挥发油类成分的变化，筛查硫熏特征成分，为硫熏菊花的质量控制及其硫熏品鉴别检测提供理论依据。

1 仪器与试药

电热套、挥发油提取器、球形冷凝管、蒸发皿、2号筛(江苏朋来生物科技有限公司)；十万分之一天平(精华科技仪器有限公司)；干燥器；FW80型高速万能粉碎机(天津泰斯特仪器公司)；Agilent7693型气相-质谱联用仪；菊花(经江苏省中医药研究院伍成颖副研究员鉴定为菊科植物ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序)；升华硫(国药集团化学试剂有限公司)；95%乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；其他物质均为分析纯。

2 样品的制备

2.1 非硫熏菊花的前处理

取菊花100 g，适量喷水并搅拌，使之得到均匀润湿，30 min后，40℃烘干，粉碎过2号筛，得到非硫熏菊花样品，备用。

2.2 硫熏菊花的制备

称取菊花样品200 g，以适量水润湿30 min后，置于干燥器的上层，下层点燃药材量20 %的升华硫，密闭，待硫磺燃尽后取出，烘干(<40℃)，粉碎过2号筛，得到菊花硫熏样品，备用。

2.3 挥发油的提取

水蒸气蒸馏法：称取药材粉末100 g至圆底烧瓶中，烧瓶上接挥发油提取器，待停止出油为止，静置取出，无水Na2SO4脱水，4℃避光密封保存备用。

2.4 菊花硫熏前后挥发油类成分的GC-MS/MS解析

2.4.1 气相色谱条件 Agilent7693型气相-质谱联用仪；色谱柱为DB-5MS，载气为He，流量为1 mL/min，进样口温度为200 ℃，进样量为1 μL，辅助加热器温度为250 ℃。程序升温，升温程序为：初始温度50 ℃，维持10 min；以5 ℃/min升至150℃，保持6 min；再以5 ℃/min升至200 ℃，保持6 min；然后以5 ℃/min升至250 ℃，保持6 min；以10 ℃/min的速度升至300 ℃，保持10 min。

2.4.2 质谱条件 电离源70 eV，采集方式：选择离子扫描模式，离子源温度为230 ℃，加速电压200 eV，扫描质量范围(m/z)为50～800。在NIST-08数据库中进一步匹配以确定挥发油的成分。根据所得色谱峰数据，面积归一化法算出所得菊花硫熏前后的挥发油中的各个成分的相对含量。

3 结果

3.1 菊花硫熏前后挥发油的性状与产率

通过比较发现：硫熏前，菊花的挥发油提取率为0.20%、呈现浅绿色且具有香味；硫熏后降至0.15%、呈现黄色且有刺鼻的硫磺味。初步判断硫熏前后挥发油性状的变化由硫磺熏蒸后残留的未知成分如二氧化硫及其衍生物造成。

3.2 菊花硫熏前后挥发油类成分的GC-MS/MS解析

从非硫熏与硫熏菊花挥发油中分别检测出242、261个色谱峰，如图1所示，其中非硫熏组与硫熏菊花挥发油筛选含有的成分分别有201、227个，非硫熏组挥发油鉴定含有的成分有桉树素、樟脑、内式-龙脑、百里酚、叶绿醇、香叶基异丙基苯、β-金合欢烯、石竹烯、水芹烯、β-甜没药烯、顺-澳白檀醇、香芹酮、马兜铃烯、2,6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯基)-二环[3.1.1]庚二烯、2-(2,4-己二烯基)-1,6-二氧杂螺[4.4]非-3-烯、P-薄荷1,5-二烯-8醇、顺-p-薄荷-2,8-二烯-1-醇、1,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基-萘、乙酸桃金娘烯酯、异戊酸龙脑酯、1-(1-丁烯-3-基)-2-乙烯基-苯、(1S,内)1,7,7-三甲基醋酸酯二环[2.2.1]庚烷-2-醇、(9S,10R)-9,10-环氧-3Z,6Z-二十一碳二烯等共26个。

硫熏组鉴定含有的成分有桉树素、樟脑、内式-龙脑、百里酚、叶绿醇、香叶基异丙基苯、α-松油醇、(1S,3R,6R)-(-)-4-蒈烯、α-杜松醇、荜澄茄油萜、氧化香橙烯、脱氢香橙烯、9,10-脱氢-异长叶烯、1-甲基-8-(1-甲基乙基)-三环[4.4.0.0(2,7)]dec-3-烯-3-甲醇、5,7-二乙基-5,6-癸二烯-3-炔等共21个。

图1 非硫熏菊花挥发油与硫熏后菊花挥发油GC-MS/MS总离子流图

通过GC-MS/MS条件分析硫熏与非硫熏菊花挥发油成分，从非硫熏组、硫熏组菊花挥发油中经鉴定筛选出201、227个化学成分，其中硫熏与非硫熏菊花挥发油共有的化学成分有27个，分别占27.75%、32.73%，见表1。

共有成分主要有桉树素、樟脑、内式-龙脑、1,3-二嗪、(1S,内)1,7,7-三甲基醋酸酯、7-亚甲基-二环[4.1.0]庚烷、N,N,2-三苯基-咪唑二胺、[S-(R*,S*)]-3-(1,5-二甲基-4-己烯)-6-亚甲基-环己烯，占非硫熏与硫熏菊花挥发油总量的22.06%、19.69%。

如表1所示，通过对比可知，经过硫熏后，很多菊花挥发油成分的含量大幅度减少了，比如桉树素、樟脑、内式-龙脑等，这说明硫熏处理可导致菊花有效成分含量减少，进而影响菊花的功效。

3.3 硫熏后新出现的成分

通过对比非硫熏组与硫熏组中菊花挥发油成分，结果发现硫熏后出现了硫熏前不含有的成分，如表2所示，共72个，占总量的54.95%。

3.4 硫熏后消失的成分

通过对比非硫熏组与硫熏组菊花挥发油成分，结果发现硫熏前含有的部分成分经过熏蒸后消失了，如表3所示，消失的成分共50个，占56.89%。其中，水芹烯、石竹烯、β-金合欢烯、顺-p-薄荷-2，8-二烯-1-醇、异戊酸龙脑酯、β-甜没药烯、顺-澳白檀醇、淫羊藿醇、香芹酮共占8.06%。

3.5 初步判断硫熏后产生的成分

可以初步判断硫熏后产生的含硫成分有35个，部分新含硫化学成分见表4。

表1 硫熏与非硫熏菊花挥发油共有成分

(续表1)

表2 硫熏后新出现的成分

(续表2)

(续表2)

表3 硫熏后消失的成分

表4 硫熏后新化学成分推断列表

4 讨论

本研究首次利用GC-MS分析非硫熏与硫熏菊花挥发油类成分，发现菊花在硫熏过程中存在化学成分的转归，菊花经过硫磺熏蒸后，不仅菊花粉末的颜色、香味和质地均发生了明显变化，而且挥发油的颜色、气味以及挥发油的提取率也受到了影响。样品经GC-MS/MS解析后发现，菊花经硫磺熏蒸后挥发油类成分含量部分有所下降或者成分消失，但也出现了一些新的含硫成分，质谱检测结果表明，未硫熏样品中几乎不含硫，而经硫磺熏蒸后，含硫成分明显增加。

硫磺熏蒸后的中药材,能较好地防虫防霉,改善中药材的外观颜色,增加成品的色泽美感,在中药材的贮藏运输和提高商品价值等方面具有较大优势。然而,硫磺熏蒸中药材中有害物质的残留对中药材品质、临床疗效及人体健康均造成极大影响与危害。从中药材的“安全”原则来看,硫磺熏蒸缺点远大于优点。

菊花中化学成分复杂，通过对比可知，经过硫熏后，很多菊花挥发油成分的含量大幅度减少，比如桉树素、樟脑、内式-龙脑等，硫熏处理可导致菊花有效成分含量减少，也有新的成分产生，具体机制尚不明确，菊花经硫熏之后，导致其他多种成分的复杂变化,临床药理和毒理作用也将发生改变。本研究不足之处主要在于未涉及硫熏菊花的相关药理、毒理方面的实验，因此,后续将进一步分析菊花硫熏前后的化学成分组分结构差异性以及这些差异带来的药理及毒理的影响,并根据研究结果进一步探索更为确实有效的硫磺熏蒸菊花的质量评价方法，为中药材和中药饮片市场的规范化提供技术支撑。