敲减lincRNA-p21的巨噬细胞对结肠癌细胞CT26生物学功能的影响

周李宁，刘月琴，苏兆亮，周峰，许化溪

(1.江苏大学医学院免疫学研究室, 江苏 镇江 212013；2.南通市第一人民医院检验科，江苏 南通 226001；3.江苏大学第四附属医院中心实验室，江苏 镇江 212001)

巨噬细胞是一类具有较强可塑性的免疫细胞[1]。在不同的环境下，巨噬细胞可极化为具有不同表型及功能的细胞，主要包括M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞[2]。M1型巨噬细胞可以分泌大量的促炎因子如IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子(TNF-α)、活性氧(ROS)和一氧化氮合酶(iNOS)等，具有很强的促炎功能，而M2型巨噬细胞可以分泌多种抑炎因子如IL-4、IL-10和转化生长因子(TGF-β)等，可促进炎症消退，具有免疫抑制功能[3]。巨噬细胞在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，许多研究表明在癌症早期，肿瘤发生部位的巨噬细胞大多是M1型巨噬细胞，发挥抗肿瘤作用；当疾病恶化，病变部位的巨噬细胞将转变为M2型巨噬细胞，发挥促进肿瘤增殖、侵袭及转移的作用。目前，调控肿瘤相关巨噬细胞M2型极化的具体分子机制尚不明确[4]。长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类不编码蛋白且转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子[5]。近年来表明，lncRNA可调控细胞的分化和增殖，但能否调控巨噬细胞M2型极化尚不清楚[6]。本研究通过干扰巨噬细胞中长链基因间非编码RNA-p21(lincRNA-p21)的表达，分析其对结肠癌细胞增殖和肿瘤生长的影响，为干预肿瘤相关巨噬细胞M2型极化提供潜在的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

10只6～8周龄C57BL/6品系小鼠，雌性，体重(20±2)g，购于江苏大学实验动物中心(合格证编号：NO.201806076)。小鼠CT26结肠癌细胞株及RAW264.7小鼠单核巨噬细胞购于上海生命科学研究院细胞库。DMEM和胎牛血清(美国Gibco公司)；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒(日本TaKaRa公司)；LipofectamineTM2000(美国Invitrogen公司)；lincRNA-p21 siRNA、阴性对照(NC)siRNA(苏州吉玛股份有限公司)；Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)；Transwell小室(美国Corning公司)；0.4 μm共培养小室(美国Millipore公司)；正置荧光显微镜(日本Nikon公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 目的基因表达水平的检测

CT26肿瘤细胞用高糖DMEM培养基(10%胎牛血清)培养，将细胞置于37℃、含5%CO2的恒温细胞培养箱中培养，当细胞生长良好，达到80%～90%汇合度时进行细胞传代。收集CT26肿瘤细胞的培养上清液，于4℃、500×g离心5 min；再用0.22 μm滤器进行过滤，-20℃保存。将RAW264.7巨噬细胞接种于24孔板内，当细胞密度至50%～60%时，分为两组：对照组和CT26肿瘤上清液刺激组。对照组常规培养，CT26上清液刺激组则加入800 μL CT26细胞培养上清液继续培养48 h。收集细胞，加入1 mL的Trizol裂解细胞，提取RNA。将RNA逆转录为cDNA后以β-肌动蛋白为内参，实时荧光定量PCR检测lincRNA-p21的表达水平。所用引物序列：β-肌动蛋白上游5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′，下游5′-GCTGTGGTGGTGAAGCTGTA-3′；IL-4上游5′-CCTCTGTGGGCTGTCTGATTTT-3′，下游5′-GGGCTCACCCAGGACCTT-3′；IL-6上游5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTT-3′，下游5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′；IL-10上游5′-CCAA-GCCTTATCGGAAATGA-3′，下游5′-TTTTCACAGGGGAGAAATCG-3′；lincRNA-p21上游5′-CCTGTCCAC-TCGCTTTC-3′，下游5′-GGAACTGGAGACGGAATG-TC-3′。扩增反应条件为95℃预变性5 min；95℃变性10 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s；进行40个扩增循环；72℃再延伸10 min。待实时荧光定量PCR扩增结束后，根据反应测得的Ct值计算2-ΔΔCt值分析目的基因的相对表达量。

1.3 RAW264.7的转染

委托公司设计针对小鼠来源的lincRNA-p21的siRNA(si-lincRNA-p21)及阴性对照siRNA(NC)。转染前1天将状态良好的RAW264.7转种到24孔板中37℃、5% CO2培养24 h，使细胞汇合度达到60%～70%。转染前，配制转染复合物，同时弃去24孔板中旧的培养液，加入400 μL无血清DMEM培养液。将100 μL的混合液加入到24孔板中，37℃、5% CO2培养6 h。转染6 h后，更换培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液，继续培养24～48 h，再进行转染后的其他检测。

1.4 流式细胞术检测CT26的凋亡

接种CT26细胞于24孔板中，37℃、5%CO2下培养12 h，将0.4 μm共培养小室置于24孔细胞培养板内，分为两组，上室分别加入转染NC siRNA的RAW264.7和转染si-lincRNA-p21的RAW264.7，37℃、5% CO2共培养48 h。取出上室，1 mL的PBS清洗下室CT26细胞，收集两组下室CT26细胞，4℃、2 000 r/min离心5 min，弃去上清液，取100 μL缓冲液重悬细胞沉淀。每管分别加入5 μL Annexin-V-APC抗体和10 μL PI抗体，轻柔混匀，4℃避光染色15 min，最后加入400 μL缓冲液混匀细胞，于1h内上机检测。根据流式细胞术的结果，(AnnexinV-APC)-/PI+为坏死细胞，(AnnexinV-APC)-/PI-为活细胞，(AnnexinV-FITC)+/PI-为早凋细胞，(AnnexinV+FITC)+/PI+为晚凋细胞，(AnnexinV-FITC)+/PI-和(AnnexinV+FITC)+/PI+的细胞比例即凋亡细胞比例。

1.5 Transwell检测CT26细胞的迁移能力

在24孔板内接种转染NC siRNA的RAW264.7和转染si-lincRNA-p21的RAW264.7，37℃、5% CO2共培养12 h，弃去培养液，更换800 μL含10% 胎牛血清的DMEM培养液，取Transwell小室置24孔板内，计数CT26细胞，每个小室接种1.5×105个肿瘤细胞，并用200 μL无血清DMEM混匀，使肿瘤细胞均匀分布于上室，于37℃、含5% CO2的恒温细胞培养箱中培养24 h。培养结束后，取出上室，用棉签擦除小室内没有穿过微孔的细胞，再将小室置于4%多聚甲醛中固定30 min，结晶紫染色10 min，PBS洗3次，每次10 min，倒置小室待干，显微镜观察并计数穿过微孔的细胞数量。

1.6 划痕实验检测CT26细胞的迁移能力

在24孔细胞培养板下室培养CT26，每孔接种1×105个肿瘤细胞。同时将0.4 μm共培养小室放置于24孔细胞培养板，将1×105个转染后的RAW264.7均匀分布于上室，将细胞置于37℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中培养48 h。共培养结束后，取出上室，用PBS缓冲液清洗下室肿瘤细胞后，更换下室培养液为无血清的DMEM培养液，并用小号枪头于24孔板中轻轻划出一道横线。将24孔细胞培养板置于倒置显微镜下拍照，记录划痕宽度及面积，再将细胞置于37℃、5% CO2的恒温细胞培养箱中继续培养36 h。培养结束后，用PBS缓冲液清洗下室肿瘤细胞3次，将24孔细胞培养板置于倒置显微镜下拍照，记录划痕宽度。

1.7 荷瘤小鼠模型的建立及肿瘤生长相关指标的检测

培养CT26肿瘤细胞，当细胞生长良好时，收集细胞并计数。选取12只C57BL/6小鼠，随机分为2组(n=6)，用酒精棉球对其背部皮肤进行消毒，用镊子轻轻夹起其背部一侧皮肤，用1 mL注射器吸取含1×106个CT26肿瘤细胞的PBS缓冲液100 μL，注射入小鼠皮下。1×106个转染si-lincRNA-p21的RAW264.7注射于实验组小鼠的荷瘤部位，每周1次，连续4周。对照组小鼠荷瘤部位注射1×106个转染NC siRNA的RAW264.7。待可触及小鼠皮瘤肿块时，每隔3天用游标卡尺测量小鼠肿瘤块的长径及宽径。根据公式V= 1/2×a×b2(a为长径，b为短径，单位为mm)计算小鼠肿瘤块的体积。4周后处死小鼠，剥取其皮下肿瘤组织，用电子分析天平测量小鼠瘤块质量。

1.8 统计学分析

应用SPSS 16.0软件处理并进行统计学分析，两组样本间均数差异分析采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CT26上清液刺激导致RAW264.7巨噬细胞极化

实时荧光定量PCR检测表明，与常规培养的RAW264.7(对照组)相比，CT26肿瘤上清液刺激的RAW264.7 IL-6表达明显下调(t=8.829，P<0.01)；而IL-4(t=10.030，P<0.01)和IL-10的表达上调(t=8.405，P<0.01)，见图1。结果提示，CT26肿瘤上清液刺激巨噬细胞后可促进巨噬细胞向抑炎的M2型极化。

图1 实时荧光定量PCR检测巨噬细胞IL-6、IL-4及IL-10的表达

2.2 CT26上清液刺激导致RAW264.7的lincRNA-p21表达上调

实时荧光定量PCR检测表明，与对照组相比，CT26肿瘤上清液刺激的RAW264.7 lincRNA-p21表达明显上调(t=5.736，P<0.01)。而转染si-lincRNA-p21后，则lincRNA-p21的表达下调(t=7.745，P<0.01)，见图2。

2.3 抑制巨噬细胞lincRNA-p21的表达对巨噬细胞极化的影响

实时荧光定量PCR检测表明，与NC组相比，CT26肿瘤上清液刺激的转染si-lincRNA-p21的RAW264.7 IL-6表达明显上调(t=8.341，P<0.01)；而IL-4(t=5.750，P<0.01)和IL-10的表达下调(t=6.493，P<0.01)，见图3。结果显示抑制巨噬细胞lincRNA-p21的表达可促进巨噬细胞向促炎的M1型极化。

图2 实时荧光定量PCR检测lincRNA-p21的表达

图3 实时荧光定量PCR检测转染后巨噬细胞IL-6、IL-4及IL-10的表达

2.4 抑制巨噬细胞lincRNA-p21的表达对CT26凋亡和迁移的影响

Transwell小室和划痕实验结果显示，与NC组相比，转染si-lincRNA-p21的RAW264.7与CT26共培养后，其迁移能力减弱(t= 3.384，P<0.05)，见图4、图5。流式细胞分析表明，与转染si-lincRNA-p21的RAW264.7共培养后，早期凋亡和晚期凋亡的CT26细胞凋亡率总和增加(t= 4.608，P<0.01)，见图6。

图4 Transwell检测CT26的迁移能力(结晶紫染色×100)

图5 划痕实验检测CT26的迁移能力

2.5 抑制巨噬细胞lincRNA-p21表达可延缓荷瘤小鼠皮下瘤的生长

与NC组相比，注射转染si-lincRNA-p21的RAW264.7的小鼠，第19、22和25天肿瘤体积明显减小(t分别为2.877、3.205、3.421，P<0.05)。4周后，肿瘤重量也明显减少(t= 3.151，P<0.05)，见图7。

图6 流式细胞术检测CT26的凋亡

*：P<0.05，与NC组相比

3 讨论

肿瘤微环境包括肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞及细胞外基质中的非细胞成分，其中巨噬细胞不仅参与固有免疫应答，还可通过抗原提呈作用介导特异性免疫应答[7]。但是越来越多的研究表明，在癌症的中后期，巨噬细胞在肿瘤微环境的驯化下，可极化为与M2型巨噬细胞类似的肿瘤相关巨噬细胞，其抗原提呈能力减弱，进而发挥免疫抑制功能，促进肿瘤的发展及转移[8]。同时肿瘤相关巨噬细胞还分泌大量的细胞因子抑制T细胞的活性进而影响其发挥抗肿瘤免疫。此外，肿瘤相关巨噬细胞还分泌多种趋化因子，募集更多的巨噬细胞到达肿瘤部位促进肿瘤发展[9]。有研究表明，肿瘤相关巨噬细胞的数量与结肠癌的预后相关，减少肿瘤相关巨噬细胞的数量可抑制肿瘤的发展及转移[10]。

LncRNA作为一类不编码蛋白质且长度超过200个核苷酸的RNA分子，一直被认为是转录组的“噪音”，近年来大量研究表明，lncRNA具有许多生物学功能，可以调控细胞的分化和发育[11]。关于lncRNA调控巨噬细胞分化仍不明确。我们先期的研究发现，经结肠癌细胞CT26培养上清液刺激，巨噬细胞可高表达lincRNA-p21，由此推测lincRNA-p21可调控巨噬细胞向M2型转化。有文献报道，lincRNA-p21位于调节细胞周期的p21基因的上游，可调控细胞增殖、凋亡和DNA损伤，是p53的转录靶标[12]。同时lincRNA-p21也可通过募集不均一核糖核蛋白K至p21启动子处，调控p21的表达[13]。但是关于lincRNA-p21调控巨噬细胞分化还鲜见报道。本研究发现，抑制巨噬细胞中lincRNA-p21的表达后，再与结肠癌细胞共培养可促进结肠癌细胞的凋亡，同时也可抑制结肠癌细胞的迁移能力。动物实验的结果也显示，抑制巨噬细胞lincRNA-p21的表达可有效延缓荷瘤小鼠肿瘤的生长。

综上，本研究发现lincRNA-p21具有潜在调控巨噬细胞分化的功能，抑制其表达，可促进巨噬细胞发挥抗肿瘤免疫，促进肿瘤细胞的凋亡。但lincRNA-p21调控巨噬细胞发生极化和促进肿瘤细胞凋亡的机制尚不明确，仍需进一步研究。