不同穴组电针预处理减轻肝脏缺血再灌注损伤的效应研究

谭思由，陈文雁，孔高茵，刘景诗，魏 来

（湖南师范大学附属第一医院麻醉科，长沙 410005）

肝脏缺血再灌注损伤是指肝脏在缺血后恢复其血流供应时，肝细胞的代谢和功能障碍以及细胞形态和组织结构损伤较肝脏缺血时更为严重的一种现象，是一种常见于外科手术如肝脏切除术、肝移植术后、以及发生失血性休克和肝脏创伤时的严重并发症［1-2］。HIRI 可造成肝脏部分切除患者或者肝移植患者肝脏功能的受损和下降，导致手术失败甚至患者死亡。有相关研究显示针刺具有抗炎、抑制应激反应的效应［3-5］，然而电针是否具有防治肝脏缺血再灌注损伤，改善肝脏功能的作用尚不明确，且缺少对刺激穴位选择的相关研究。根据文献报道和中医经典理论，肝脏相关的穴位有肝俞、阳陵泉、太冲、内关等穴，本文旨在中医理论指导下探究以上穴位不同的组合对肝脏缺血再灌注损伤发挥的效应，揭示不同的穴位选择治疗效果的差异性，为临床防治HIRI 提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 SPF 级雄性SD 大鼠70 只，体质量200g±20g（湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SYXK（湘）2015-0013），以上大鼠按照随机数字表分为假手术组、模型组、肝俞组、肝俞+阳陵泉组、肝俞+内关组、肝俞+太冲组、非经非穴组共7 组，每组各10 只，实验过程严格遵照科技部（2006）398 号《关于善待实验动物的指导性意见》文件要求执行［6］。

1.2 主要仪器和试剂 仪器：SDZ-II 型华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司），不锈钢毫针（华佗牌，苏州医疗用品有限公司），AnymicroDSSTM 图像采集系统，德国LEICARM2245 型石蜡切片机，全自动生化分析仪（siemens 公司，德国）；试剂：苏木素-伊红（HE）染色液（北京普利莱基因技术有限公司），TNF-α、IL-6 检测试剂盒（北京环宇金科生物医学技术有限公司）；药品：麻醉剂采用浓度为10%水合氯醛溶液（天津市科密欧化学试剂有限公司）。

1.3 各组干预方法 参照《实验针灸学》的标准取穴［8］，肝俞组取大鼠两侧肝俞穴；肝俞+阳陵泉组取两侧肝俞和阳陵泉穴；肝俞+内关组取两侧肝俞和内关穴；肝俞+太冲组取两侧肝俞和太冲穴；非经非穴组取两侧肝俞穴区旁开6～8mm 左右的非经非穴肌肉结缔组织。固定大鼠后，选用规格为0.30mm×13mm 的不锈钢毫针，消毒后将针刺入相应穴位（区域），左右各一对，针刺深度均为5mm。同侧两根毫针分别连接电子针疗仪正负极，接通电源后将波形调至疏密波，频率为2/100Hz，强度以能见到针体颤动为宜，干预时间为30min，干预结束后即开始构建70%HIRI 模型。

模型组操作见1.4，假手术组仅行剖腹、肝门暴露1h 后缝合，不行其他任何手法操作。

1.4 70%HIRI 模型的制备 对于模型组、肝俞组、肝俞+阳陵泉组、肝俞+内关组、肝俞+太冲组、非经非穴组，参照Zabala［7］等方法，大鼠禁食6h，自由饮水，行10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉（350mg/kg）后，固定大鼠、备皮、消毒，于剑突下沿正中线作一约 3cm 切口。暴露肝门后解剖肝十二指肠韧带，并进一步分离供应肝左叶和肝中叶的动脉、静脉和胆管，然后应用无创血管夹阻断1h，诱发70%肝脏热缺血（liver warm ischemia，IWI）。松开血管夹后腹部滴入0.5mL 生理盐水并缝合腹部切口，4h 后肝脏再灌注完成。成功构建70%HIRI 模型后，行大鼠腹主动脉穿刺取血3～4mL 于采血管中，直立静置30min 后4˚C 、1，500 × g 离心20 min，取其上清-20 ˚C 保存，同时迅速切取肝脏组织置于10%中性福尔马林溶液中固定。

1.5 观察指标

1.5.1 形态学观察 在再灌注4h 后收取各组肝中叶及肝左叶组织标本，放置于10%中性福尔马林溶液中固定48h，随后利用苏木精尹红（HE）染色光镜下观察各组肝脏组织病理形态，并行肝脏组织病理损伤评分。评分标准为：0 分：静脉血管及肝小叶内无炎性细胞浸润及肝细胞变性、坏死；1 分：汇管区少量炎细胞浸润，肝细胞少量变性及坏死；2 分：肝小叶内散在肝细胞变性及灶状坏死，肝组织内较多炎性细胞浸润，肝小叶结构尚完整；3 分：肝窦、肝中央静脉内游血，广泛肝细胞变性、坏死，肝组织大量炎性细胞浸润，部分肝小叶破坏［9］。

1.5.2 血清ALT、AST 检测 在再灌注4h 后从腹主动脉取血3～4mL，所获取的标本均于24h 内利用全自动生化分析仪检测血清中ALT 和AST 水平。

1.5.3 ELISA 法测定血清TNF-α 和IL-6 水平 TNF-α和IL-6 ELISA 试剂盒购自北京环宇金科生物医学技术有限公司。将目的蛋白单抗包被于酶标板，加入试剂盒内抗目的蛋白抗体以及亲和素，加显色底物和终止液，用酶标仪测定450nm 波长下吸光度值，并通过绘制标准曲线计算蛋白水平。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0.1 软件进行统计分析，计量资料均采用mean±SD 表示，两样本均数间比较用t 检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下各组大鼠肝脏组织病理改变及病理损伤评分的比较 病理结果显示假手术组肝小叶结构完整清晰，汇管区内未见明显炎症细胞浸润，肝窦及肝细胞索结构正常，未见有明显的肝细胞变性及坏死；模型组肝组织细胞大范围出血坏死，汇管区大量炎症细胞浸润中央静脉，肝窦内亦有大量炎症细胞浸润，大量肝细胞索结构破坏，肝小叶结构尚正常；其余五组可见部分肝细胞水肿变性、坏死，散在空泡样变性，肝窦及汇管区可见少量炎性细胞浸润，部分肝细胞索结构破坏，见图1。评分结果：肝俞组、肝俞+阳陵泉组、肝俞+内关组、肝俞+太冲组各组间差异无统计学意义（P>0.05），但以上四组各组评分均高于假手术组（P<0.01），且低于模型组和非经非穴组（P<0.01），且模型组和非经非穴组损伤评分差异无统计学意义（P>0.05），见图1H。

图1 各组大鼠肝脏组织病理改变（HE，X200）和损伤评分A：假手术组；B：模型组；C：肝俞组；D：肝俞+阳陵泉组；E：肝俞+内关组；F：肝俞+太冲组； G：非经非穴组；H：肝脏组织病理损伤评分

2.2 各组大鼠血清中ALT、AST 水平的比较 与假手术组相比，模型组大鼠血清中ALT 和AST 水平明显升高（P<0.01），电针预处理后非经非穴组与模型组之间差异无统计学意义（P>0.05），模型组和非经非穴组ALT与AST 水平均高于肝俞组、肝俞+阳陵泉组、肝俞+内关组和肝俞+太冲组（P<0.01），各电针组两两之间比较，肝俞+阳陵泉组ALT（P<0.05）和AST（P=0.011）水平低于肝俞组，但其余各组之间ALT 和AST 差异无统计学意义（P>0.05）。详见图2A、B。

2.3 各组大鼠血清炎性因子水平的比较 与假手术组相比，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平明显升高（P<0.01），经电针预处理后非经非穴组与模型组之间差异无统计学意义（P>0.05），但肝俞组、肝俞+阳陵泉组、肝俞+内关组、肝俞+太冲组TNF-α、IL-6 水平均较模型组和非经非穴组降低（P<0.01），各电针组两两之间比较，肝俞+阳陵泉组TNF-α（P<0.05）、 IL-6（P<0.05）水平低于肝俞组，其余各组之间ALT 和AST 差异无统计学意义（P>0.05），详见图2C、D。

图2 各组大鼠血清中ALT、AST、TNF-α和IL-6水平比较注：*P<0.05；**P<0.01

3 讨论

HIRI 并不局限于肝脏的病理生理过程，而是一个涉及多个组织器官的复杂的系统过程。HIRI 可严重损害肝功能，甚至产生不可逆的损伤，引起多个器官的功能障碍。厌氧代谢、线粒体损伤、氧化应激、ROS 分泌、细胞内Ca2+超载、中性粒细胞产生的细胞因子和趋化因子以及NO 等都参与了HIRI 的发生和发展［10-11］。

既往研究中，电针能够改善心、脑、肾等器官的缺血再灌注损伤［12-14］，但目前关于电针对HIRI 保护性效应的研究很少，而且针对于相关穴位选择和搭配的研究更加匮乏。在中医理论中，肝俞是肝脏的背俞穴，是肝脏之气输注于背部的特定穴，有调整肝脏功能的作用，如《千金方》：肝俞主“积聚病痛，两胁急痛”；《针灸甲乙经》：“肝胀者，肝俞主之，《针灸大全》：“肝俞……五积气块，血积业癖”，等等。太冲是肝经的原穴，亦可以治疗肝脏的疾病，正如《灵枢·九针十二原》所说：“五脏有疾，当取之十二原”；“五脏有疾也，应出十二原”；“阴中之少阳，肝也，其原出于太冲”，按照根结、标本理论，太冲与肝俞配伍能够起到治疗肝脏疾病，保护肝脏功能的效果。 而阳陵泉是治疗胆腑疾病十分有效的穴位，《灵枢·邪气脏腑病形》中提到：“胆病者，善太息，口苦，呕吐宿汁，心下潺潺，恐人将捕之，隘中介介然，数唾……取阳陵泉”，《针灸甲乙经》亦云“胁下支满，呕吐逆，阳陵泉主之”，此穴与肝俞配伍能起到肝胆同治，发挥护肝利胆的有益作用。内关穴常常用于主治心痛、惊悸、神昏等，具有醒神定志的功能，其与肝俞穴配伍能起到扶正祛邪，调和阴阳，疏通经络，使失调的气血津液或脏腑趋向正常状态的作用。故而选择以上所述穴位，以肝俞为主穴，分别配伍太冲、阳陵泉、内关，研究比较三组配穴抗HIRI 的效应。

本研究结果显示：穴位电针预刺激具有防治肝脏缺血再灌注损伤的作用，且穴位配伍的不同在防治HIRI 上具有不同的效应，通过肝脏缺血前同时刺激肝俞、阳陵泉二穴相对于刺激肝俞+太冲、肝俞+内关和单一刺激肝俞穴可能具有更好的减轻HIRI 的作用。该作用主要体现为：电针预刺激能够减轻大鼠缺血再灌注肝脏细胞坏死的严重程度；以及能够减少汇管区和肝窦内炎症细胞的聚集，保护正常的肝脏组织结构。另外，在肝俞组、肝俞+阳陵泉组、肝俞+内关组和肝俞+太冲组中，各电针穴组的肝脏组织损伤评分差异不具有统计学意义，而肝俞+阳陵泉组和肝俞组两组之间比较，前者血清转氨酶和TNF-α、IL-6 水平更低，肝俞组相对于肝俞+内关组和肝俞+太冲组无明显差异。本结果一方面说明了转氨酶和相关血清学指标也许比肝脏病理损伤评分能更早的提示HIRI 的发生；另一方面，说明了肝俞穴和阳陵泉穴配伍相对于其它穴位配伍可能具有更好的抗HIRI 效应。本团队在本次结果的基础上，结合既往研究考虑，扩大样本量和丰富检测指标的多样化或许能够得到更为确切的研究结果。此外，针对于不同的电针干预参数结合特定穴位是否发挥了不同的抗肝脏缺血再灌注损伤的作用还有待进一步的研究。

本研究证明了穴位电针预刺激能够有效减轻肝门阻断引起的肝脏缺血再灌注损伤，且该效应因配伍穴组的不同而有差异，并证明了肝俞穴与阳陵泉穴配伍相对于单一刺激肝俞穴具有更显著的作用，但是其内在机制仍待进一步研究。本项研究得出的结果有可能对于进一步探索穴位配伍效应的研究模式有一定的启发意义，以此来验证并揭示穴位功能与机体状态的相关规律，在科学研究基础上，建立并优化有效的穴位配伍方案，为临床治疗和研究提供依据。