结直肠癌组织中DNA 甲基转移酶-1和钠氢交换子调节因子1 的表达、临床意义及相关性

高晓斌 武雪亮 赵轶峰 聂双发 梁 峰 刘小飞 张迎春

1.河北北方学院附属第一医院普通外科，河北张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院小儿外科，河北张家口 075000

最新流调数据显示，2014 年我国结直肠癌发病例数上升至第三，其整体5 年生存率并未有明显提高，较欧美仍有较大差距[1-2]。目前，手术辅以放化疗在结直肠癌的治疗中已非常成熟，从分子生物学角度寻求敏感度高、特异性强的标志物以提高肿瘤的早期诊断率已成为结直肠癌的研究热点[3]。

DNA 甲基转移酶是人类表观遗传学中催化并维持DNA 基化结构和功能的重要酶家族[4]，其包含3 个重要成员：DNMT1、DNMT2 和DNMT3，其中DNMT1是目前研究最为广泛也最为深入的酶类，其在DNA修复和正常甲基化功能过程中发挥关键作用。研究证实，DNMT1 的活性增强或表达上调能介导DNA 异常甲基化，与胃癌、胰腺癌、宫颈癌等肿瘤的发生、发展密切相关[5-7]，但在结直肠癌中的研究较少。钠氢交换子调节因子-1（NHERF1）是近年来发现的一种新的抑癌基因，目前仅在乳腺癌、胃癌中发现其抑癌作用[8-9]，在结直肠癌中的研究尚未见报道。本研究通过对结直肠癌和相应正常组织中DNMT1、NHERF1 行荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和免疫组织化学检测，探讨二者在结直肠癌中的表达情况及与相关临床病理因素间的关系，同时初步探讨二者的相互作用，为结直肠癌的早期诊断和预后监测提供可靠的分子生物学标志物，为结直肠癌的靶向诊疗提供科学参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2017 年2 月～2018 年2 月河北北方学院附属第一医院（以下简称“我院”）普通外科手术切除病理确诊的结直肠癌组织和癌旁正常组织标本各50 例，同时收集患者完整的临床资料，本研究经我院医学伦理委员会鉴定批准。

1.2 主要试剂、仪器

RNA 逆转录试剂（批号：RI90401）、PCR 试剂盒（批号：9AG03J）、PrimeScriptTMRT reagent 试剂盒（批号：PR036A）购自日本TaKaRa 公司；DNMT1、NHERF1和β-catenin 引物由生工生物（北京）有限公司设计合成，全自动电化学发光免疫分析仪购自瑞士罗氏公司E2010，DEPC 水购自美国Sima 公司，DNMT1 抗体、NHERF1 抗体均购自美国Santa Cruz 公司，DAB 显色试剂盒（批号：PV9000）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 检测癌组和正常组中DNMT1 mRNA和NHERF1 mRNA 表达 按TRIzol RNA 试剂盒说明书提取总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent 试剂盒逆转录合成cDNA 2 μL 逆转录产物进行PCR 扩增，PCR 扩增引物：DNMT1 正向引物：5′-CGATGAGGAAGTCGATGATAACAT-3′，反向引物：5′-ATGCGATTCTTGTTCTGTTTCTTCT-3′；NHERF1 正向引物：5′-AGGGAAACTGACGAGTTCTT-3′，反向引物：5′-ACTGAACCTGACCGTACATT-3′；β-catenin 作 为 内参，正向引物：5′-AGGAAGCTTCCAGACACGC-3′，反向引物：5′-CGCACTGCCATTTTAGCTCC-3′。PCR 反应条件：95℃变性10 min，进行40 个循环：95℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸40 s，然后根据SYBR Green 染色法行相对定量分析，实验数据处理使用2△△Ct法，计算各样本Ct 平均值[IACt 平均值（Ct=Ctnetl-Ctl3actin），计算2△△ct（mean2△△ct值）AACt=meanAACt 值。

1.3.2 免疫组织化学法检测癌组和正常组中DNMT1和NHERF1 蛋白阳性表达 将癌组织标本连续切片4 μL 贴附于经多聚赖氨酸处理的玻片上，80℃烘烤50 min，光镜下观察切片中DNMT1、NHERF1 蛋白的表达和分布情况，每张切片选取5 个高倍视野（400×）。DNMT1 蛋白阳性主要分布于细胞核中，而NHERF1蛋白阳性主要分布于细胞质和细胞膜中，均呈棕黄色颗粒。判断标准：按染色强度[10]：无着色为0 分，淡黄为1 分，深黄2 分，棕褐或棕黄3 分；阳性细胞计数：＜10%为0 分，10%～25%为1 分，＞25%～50%为2 分，＞50%～75%为3 分，＞75%为4 分，两者相加＜2 分为阴性（-），2～3 分为弱阳性（+），4～5 分为中等强度阳性（++），6～7 分为强阳性（+++），由两名具备高级职称的病理医师经双盲法独立评分。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。应用Spearman 相关分析法分析二者的相关性。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组和正常组中DNMT1 mRNA、NHERF1 mRNA 表达

qRT-PCR 结果以目标基因与β-catenin 的比值作为定量分析结果，癌组中DNMT1 mRNA 的表达水平为（0.36±0.07），明显高于正常组（0.09±0.01）；而癌组中NHERF1 mRNA 的表达水平为（0.14±0.03），明显低于正常组（0.35±0.05），差异均有高度统计学意义（t=10.951、6.553，均P=0.000）。

2.2 结直肠癌组和正常组中DNMT1 和NHERF1 蛋白的表达

免疫组化结果显示癌组中DNMT1 阳性表达率为84.00%（42/50），明显高于其在正常组中的阳性表达24.00%（12/50）；而癌组织中NHERF1 阳性表达率为32.00（16/50），明显低于其在正常组中的表达[76.00%（38/50）]，差异均有高度统计学意义（χ2=21.545、15.559，均P=0.000）。见图1。

2.3 DNMT1 和NHERF1 蛋白的表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系

DNMT1 和NHERF1 蛋白表达均与肿瘤的浸润深度、TNM 分期、淋巴结转移及肝转移相关（均P ＜0.05）。TNM 分期高，DNMT1 表达水平越高，而NHERF1 表达水平越低（均P ＜0.05），伴淋巴结转移、肝转移的患者DNMT1 表达水平高于未转移的患者，而NHERF1的表达水平则低于未转移患者（均P ＜0.05），而DNMT1 和NHERF1 蛋白表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小及分化程度均无关（均P ＞0.0505）。见表1。

2.4 结直肠癌组织中DNMT1 和NHERF1 蛋白表达的相关性

DNMT1 和NHERF1 蛋白表达呈负相关（r=-0.491，P=0.000）。见表2。

3 讨论

研究证实，肿瘤的发生、演变不单单取决于遗传因素，同时也受到表观遗传修饰的影响，后者通过DNA 甲基化、染色体重塑、组蛋白修饰和lncRNA 等4 种主要的调控方式来调控肿瘤相关基因的表达，激活致癌基因，沉默抑癌基因，其中DNA 甲基化是目前研究最为深入的机制[11]。

图1 免疫组化检测DNMT1、NHERF1 在结直肠组织和癌组织中的表达（SP 法，200×）

表1 临床病理因素与DNMT1 和NHERF1 在结直肠癌组织中阳性表达的关系[例（%）]

表2 结直肠癌组织DNMT1 和NHERF1 表达的相关性

DNMT1 是DNA 甲基化的关键作用酶，主要介导甲基化模式的建立与维护，其高表达可以诱导甲基化模式异常，使启动子区的CpG 岛发生甲基化，相关调控基因表达受抑制，从而介导肿瘤发生[12-13]。张尤历等[14]检测DNMT1 mRNA 和蛋白在胰腺组织中的表达，发现二者在癌组织中的表达水平和阳性率均明显高于正常组织，且其表达强度与肿瘤的恶性度、淋巴结转移和神经浸润密切相关；罗玉政等[15]通过小分子干扰剂抑制人结肠癌HT-29 细胞DNMT1 的表达，证实DNMT1-siRNA 能明显抑制HT-29 细胞的增殖、促进其凋亡，降低其侵袭和迁移的能力。

NHERF-1 最初发现于人类上皮细胞，在肝脏、肾脏、胰腺、唾液腺、乳腺中均有表达，NHERFl 基因定位于染色体17q25.1，含6 个外显子，其编码蛋白质N端含有PDZ-I 和PDZ-II 两个结构域，C 端含有与ERM 家族蛋白结合的结构域[16]。NHERF-1 通过PDZ和ERM 结构域与包括血小板衍生生长因子受体、磷酸酶基因（PTEN）、脾酪氨酸激酶（SYK）等在内的多种靶蛋白质相互结合，参与调节多种信号传导途径，如Wnt 信号通路、PI3K/PTEN/Akt 通路、Hippo-YAP/TAZ 等，其中Wnt 信号通路在肿瘤细胞的增殖、侵袭及血管形成、浸润等方面发挥重要作用[17]。李阳等[18]应用免疫组织化学法检测乳腺癌组织及癌旁组织中NHERF-1 蛋白表达情况，发现癌组织中NHERF1 呈现弱阳性或不表达状态，而在癌旁正常组织中两者均有表达或高表达，考虑抑制NHERF1 蛋白的表达与乳腺癌发生关系密切。

本研究显示，DNMT1 在结直肠癌组织中表达明显高于正常组，而NHERF1 癌组织中的表达明显低于正常组，差异明显，提示在肠黏膜癌变的过程中，DNMT1 的过表达和NHERF1 的表达受抑制参与结直肠肿瘤的发生；进一步研究显示，DNMT1 和NHERF1表达水平与结直肠癌的浸润深度、TNM 分期、淋巴结和肝转移均关系密切，且二者表达呈负相关。有研究表明：DNMT1 和NHERF1 均受Wnt 信号传导途径调节，在DNMT1 高表达结直肠癌患者中，Wnt 信号通路与NHERF1 表达呈负相关，DNMT1 能抑制体内NHERF1 的表达[19]；亦有研究证实，NHERF1 是Wnt信号通路的拮抗剂之一，NHERF1 通过抑制Wnt 通路降低DNMT1 的表达，从而抑制DNA 的异常甲基化，诱导肿瘤的发生[20]。

综上，DNMT1 和NHERF1 的异常表达对结直肠癌的发生进展有重要作用，本研究仅从基因和蛋白水平分析二者在结直肠癌组织中的表达情况，其具体的相互作用机制及相关通路的研究尚不明确，这也是本研究下一步的研究方向。