二氢槲皮素对异丙肾上腺素所致急性心肌缺血大鼠心肌磷脂酰肌醇3-激酶/糖原合成酶激酶-3β信号通路的影响

吴明娟 费洪新 田 明 周忠光 韩玉生

1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江哈尔滨 150036；2.广西科技大学基础医学部，广西柳州 545005；3.黑龙江中医药大学中医研究院，黑龙江哈尔滨 150040；4.黑龙江中医药大学实验中心，黑龙江哈尔滨 150040

心血管疾病发病率近年来呈逐渐上升的趋势，其中，急性心肌缺血的发病率不断上升，其是影响全球生存率和死亡率的重要原因[1-2]。本研究通过腹腔注射异丙肾上腺素建立急性心肌缺血大鼠模型，以二氢槲皮素进行干预，观察其对血液流变学、抗氧化指标和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）信号通路影响，进一步探讨二氢槲皮素在防治心肌缺血中的作用机制及可能的作用靶点，为临床研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD 大鼠60 只，8～10 周龄，体重（200±20）g，由黑龙江中医药大学药物安全评价中心提供，实验动物许可证号：SCXK（黑）2013-004。大鼠每笼6 只，自由饮水摄食，实验室温度为（23±2）℃，湿度55%～650%，光照与黑暗周期12 h，每3 天更换1 次垫料。适应性喂养适应1 周后开始实验。

1.2 试剂

二氢槲皮素（上海源叶生物科技有限公司，批号：Z07M6B）；异丙肾上腺素（美国Sigma 公司，批号：101443898）；地奥心血康（成都地奥集团，批号：2016 1024）；肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程公司，批号：20170410、20170324、20170310、20170425、20170315、20170415）；兔抗PI3K、磷酸化蛋白激酶B、GSK-3β 抗体（美国Santa Cruz 公司，批号：sc-365290、sc-81434、sc-9166）；HRP 标记抗兔IgG 和鼠抗GAPDH 抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；组织蛋白抽提试剂、BCA 蛋白定量试剂盒、化学发光试剂盒和PVDF 膜（碧云天生物技术研究所）。

1.3 仪器

LBY-N7500B 型全自动血液流变仪（北京普利生仪器有限公司）；CPA225D 型电子分析天平（赛多利公司，精密度1/100 g）；KDC-160R 型高速冰冻离心机（科大创新股份有限公司）；2235 型组织切片机（德国菜卡公司）；Nikon E600 型光学显微镜（日本Nikon）；UV-2401 型紫外分光光度计（日本岛津公司）；Universal hood Ⅱ型凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）。

1.4 方法

1.4.1 分组、给药及造模 将60 只SD 大鼠按随机数字表法分成空白组、模型组、地奥心血康组和二氢槲皮素高、中、低剂量组，每组10 只。二氢槲皮素用0.4%羧甲基纤维素钠配制后，二氢槲皮素高、中、低剂量组大鼠给药剂量分别为60、30 mg/kg 和15 mg/kg；地奥心血康组给药剂量为54 mg/kg；空白组与模型组大鼠给予等体积羧甲基纤维素钠，每日1 次，连续灌胃给药14 d。第12 天开始，除空白组外，其余各组均腹腔注射异丙肾上腺素（ISO）5 mg/kg，1 次/d，连续3 d。

1.4.2 血液流变学检测 各组大鼠用10%水合氯醛麻醉，取静脉血5 mL 经肝素抗凝后混匀，采用LBYN7500B 型全自动血液流变仪（北京普利生仪器有限公司）检测血浆黏度、全血黏度、血细胞比容。

1.4.3 心肌组织HE 染色 各组大鼠用10%水合氯醛麻醉，取心肌组织经4%多聚甲醛固定24 h 后，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，制成5 μm 切片，进行HE 染色，Nikon E600 型光学显微镜（日本Nikon）下观察心肌组织病理变化。

1.4.4 血清中LDH、CK 和NO 检测 各组大鼠用10%水合氯醛麻醉，取血3500 r/min 离心10 min，分离血清，按试剂盒说明书分别测定血清LDH、CK、NO 含量。

1.4.5 心肌组织中SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA 含量检测 各组大鼠用10%水合氯醛麻醉，称取一定量心肌组织，制成10%的组织匀浆液，离心取上清，考马斯亮兰试剂盒测定蛋白含量。按照试剂盒操作测定心肌组织中SOD、CAT、GSH-Px 及MDA 含量。

1.4.6 Western blot 检测心肌组织中PI3K、PKB、GSK-3β 蛋白表达 称取100 mg 心肌组织，加入液氮在研钵中充分研磨后，加入裂解液混匀，4℃，12 000 r/min离心10 min，取上清；BCA 试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白浓度；蛋白变性后，上样、电泳、转膜；加入一抗4℃下孵育过夜，清洗后加入二抗孵育1 h，加入ECL发光液曝光，扫描图像后分析结果，目的蛋白与内参GAPDH 条带的灰度值比值为目的蛋白的相对含量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析（ANOVA），组间比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 二氢槲皮素对心肌缺血模型大鼠全血黏度、血浆黏度和血细胞比容的影响

与空白组比较，模型组全血黏度、血浆黏度、血细胞比容均明显升高（P ＜0.05）；与模型组比较，地奥心血康组和二氢槲皮素高、中、低剂量组血浆黏度均降低（P ＜0.05），地奥心血康组和二氢槲皮素中、低剂量组血细胞比容明显降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

2.2 二氢槲皮素对心肌组织病理学的影响

光学显微镜下可见，与空白组比较，模型组心肌纤维断裂，结构紊乱，细胞肿胀、融合呈空泡样变性坏死，细胞核固缩或脱失，间质水肿，有大量炎症细胞浸润。同时，与模型组比较，二氢槲皮素组随着给药剂量的增加，心肌病理损伤程度逐渐减轻，表现为心肌纤维排列较规整，变性坏死灶减小，水肿和炎症细胞浸润减轻。以地奥心血康组和二氢槲皮素高剂量组病理改善最为明显。

表1 二氢槲皮素对心肌缺血模型大鼠全血黏度、血浆黏度和血细胞比容的影响（，n=6）

表1 二氢槲皮素对心肌缺血模型大鼠全血黏度、血浆黏度和血细胞比容的影响（，n=6）

注：与空白组比较，#P ＜0.05；与模型组比较，*P ＜0.05。“-”表示无数据

2.3 二氢槲皮素对急性心肌缺血模型大鼠血清中LDH、CK 和NO 的影响

与空白组比较，模型组大鼠LDH、CK 水平明显增加（P ＜0.05），NO 水平明显降低（P ＜0.05）；与模型组比较，地奥心血康组和二氢槲皮素高、中剂量组LDH、CK 水平均明显降低（P ＜0.05），地奥心血康组和二氢槲皮素高、中、低剂量组NO 水平均明显增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

2.4 二氢槲皮素对急性心肌缺血大鼠心肌组织中SOD、CAT、GSH-Px 和MDA 的影响

与空白组比较，模型组大鼠心肌组织SOD、CAT、GSH-Px 水平明显降低，MDA 水平明显升高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与模型组比较，地奥心血康组、二氢槲皮素各剂量组大鼠心肌组织中SOD、CAT、GSH-Px 水平明显升高，MDA 水平明显降低，差异有 统计学意义（P ＜0.05）。见表3。

图1 各组大鼠心肌组织的病理形态变化（HE 染色，200×）

表2 二氢槲皮素对急性心肌缺血模型大鼠血清中LDH、CK和NO 的影响（，n=6）

表2 二氢槲皮素对急性心肌缺血模型大鼠血清中LDH、CK和NO 的影响（，n=6）

注：与空白组比较，#P ＜0.05；与模型组比较，*P ＜0.05。NO：一氧化氮；LDH：乳酸脱氢酶；CK：肌酸激酶。“-”表示无数据

2.5 二氢槲皮素对急性心肌缺血大鼠心肌组织中PI3K、AKT、GSK-3β 蛋白相对表达量的影响

与空白组比较，模型组心肌组织中PI3K 蛋白的相对表达量明显降低（P ＜0.05），GSK-3β 蛋白的相对表达量明显升高（P ＜0.05），而两组PKB 蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义（P ＞0.05）；与模型组比较，地奥心血康组和二氢槲皮素各剂量组大鼠心肌组织中PI3K 蛋白的相对表达量均明显升高（P ＜0.05），地奥心血康组和二氢槲皮素高、中剂量组GSK-3β 蛋白的相对表达量明显降低（P ＜0.05）；各组PKB 蛋白的相对表达量比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图2、表4。

表3 二氢槲皮素对急性心肌缺血大鼠心肌组织中SOD、CAT、GSH-Px 和MDA 的影响（，n=6）

表3 二氢槲皮素对急性心肌缺血大鼠心肌组织中SOD、CAT、GSH-Px 和MDA 的影响（，n=6）

注：与空白组比较，#P ＜0.05；与模型组比较，*P ＜0.05。SOD：超氧化物歧化酶；CAT：过氧化氢酶；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化物酶；MDA：丙二醛。“-”表示无数据

图2 各组大鼠心肌组织PI3K、PKB、GSK-3β 蛋白的表达

3 讨论

二氢槲皮素是由松科植物落叶松中提取分离出的二氢黄酮类高纯度天然化合物。药理研究表明，二氢槲皮素能够对抗异丙肾上腺素所致心肌组织缺血，保护心肌细胞免受损伤，从而起到治疗冠心病的作用[3]；能够提高细胞内抗氧化酶活性，对过氧化氢（H2O2）诱导H9c2 心肌细胞损伤有保护作用[4]；能够抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡[5]；能通过抗氧化作用减少氧自由基产生，对离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤起到保护作用[6]。

心肌缺血过程中心肌损伤是由体内外多种因素通过多种途径综合作用所导致的。氧化应激是心肌损伤级联反应中的关键环节，参与多种信号途径所引起的心肌损伤和细胞凋亡。近年来研究发现PI3K/GSK-3β 信号通路是机体中重要的细胞内信号转导通路，可以参与调节细胞分化、增殖，促进细胞生存，及维持细胞正常功能的信号传递，在对抗心肌缺血再灌注损伤、抑制心肌细胞凋亡中起到重要作用[7-8]。

表4 二氢槲皮素对急性心肌缺血大鼠心肌组织中PI3K、PKB、GSK-3β 蛋白相对表达量的影响（，n=3）

表4 二氢槲皮素对急性心肌缺血大鼠心肌组织中PI3K、PKB、GSK-3β 蛋白相对表达量的影响（，n=3）

注：与空白组比较，#P ＜0.05；与模型组比较，*P ＜0.05。PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶；PKB：磷酸化蛋白激酶B；GSK-3β：糖原合成酶激酶-3β。“-”表示无数据

研究表明，PI3K[9-11]激活并与PKB 相结合，使PKB 从胞浆转移到细胞膜上，同时PKB 上Ser473 发生磷酸化形成p-Akt[12]，作用于相应的下游靶点，如一氧化氮合酶、GSK-3β[13-14]、半胱氨酸蛋白酶-9[15-17]等，从而减少mPTP[18-20]的开放，维持细胞内各种离子浓度的稳定，改善线粒体能量代谢等功能，可见，PI3K/GSK-3β信号通路是细胞内各种离子浓度稳定的主要通路。

本研究结果显示，二氢槲皮素能够降低急性心肌缺血模型大鼠血液流变学全血黏度，降低血清中LDH、CK 水平，升高NO 水平，明显升高模型大鼠心肌组织中SOD、GSH-Px、CAT 水平和PI3K 蛋白表达，降低血清MDA 水平和心肌组织GSK-3β 蛋白表达。提示二氢槲皮素可能通过调控PI3K/GSK-3β 信号通路，抑制氧化应激级联反应，调节心肌血流量，阻断心血缺血的进程，从而发挥抗心肌缺血的作用。而更深入的机制尚不十分清楚，以后还需要进一步的探讨和研究。