3-溴丙酮酸调控JAK/STAT信号通路抗人卵巢癌细胞株A2780增殖的实验研究

郭云鸿，王瑞芳，田晓予

(河南科技大学第一附属医院 妇产科，河南 洛阳471002)

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，也是妇科恶性肿瘤患者死亡的主要病因。据统计[1]，在妇科恶性肿瘤患者中，卵巢癌的发病率仅次于子宫颈癌与子宫体癌，但是其死亡率却位居首位，且近年来随着女性社会生活压力的增加该病的发病率呈逐渐增长趋势，对我国妇女的身心健康与生命均造成了极大的危害。手术、放化疗均是目前临床上常用的卵巢癌治疗方法，但是临床疗效及远期预后仍有待改善[2，3]。3-溴丙酮酸属于己糖激酶抑制剂，在既往的报道中已经证实能够抑制包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤细胞的体外生长和增殖[4]。有研究显示[5]，将荷卵巢癌肿瘤兔模型采用肝动脉注射3-溴丙酮酸治疗发现肿瘤体积明显变小，甚至有部分肿瘤直径<1 mm的动物模型肿瘤病灶消失，证实3-溴丙酮酸具有抗卵巢癌作用。但是目前关于该药物对卵巢癌的增殖抑制作用机制研究尚少。Janus激酶/信号转导子及转录激活子(JAK/STAT)是经典的恶性肿瘤增殖信号传导调控通路[6]，但是3-溴丙酮酸是否能够调控人卵巢癌该信号通路并以此抑制恶性肿瘤细胞的增殖仍需要进一步探讨。为证实该推测，本研究特进行体外实验，以期为3-溴丙酮酸的临床应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞 人卵巢癌细胞株A2780，购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.1.2药物、主要试剂和仪器 3-溴丙酮酸购自上海晶都生物技术有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、二甲基噻唑(MTT)购自美国Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640培养基均购自美国Hyclone公司；磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海一研生物科技有限公司；逆转录、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂、二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析试剂盒均购自赛默飞世尔中国有限公司；兔抗人JAK2、STAT3单克隆抗体(一抗)、山羊抗兔JAK2、STAT3多克隆抗体(二抗)均购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养、分组及干预 用RPMI1640(含浓度为10%胎牛血清)的培养液对人卵巢癌细胞株A2780培养，培养条件为：37℃、5 % 二氧化碳培养箱。观察细胞生长情况，直至处于对数期时进行分装，分装参数为：1.5×106个细胞/孔，设置低、中、高剂量组和对照组，每组各包含5个复孔。继续培养待细胞贴壁生长后，3剂量组分别加入25、50、100 μmol/L浓度的3-溴丙酮酸，对照组加入等量PBS，继续在37℃、5 % 二氧化碳培养箱中培养72 h。

1.2.2细胞形态学变化 用透射电镜在400倍下分别观察培养24 h、48 h和72 h后的细胞形态学变化。

1.2.3增殖抑制率变化 利用MTT法检测3剂量组细胞培养24 h、48 h和72 h后的增殖抑制率。收集上述各时刻细胞，每孔分别加入20 μl MTT溶液，继续在37℃、5 % 二氧化碳培养箱中培养4 h，将培养液撇去，每孔分别加入150 μl DMSO溶液，轻轻吹打，至溶液澄清且无结晶后利用试剂盒测定570 nm处波长的光密度值(OD)，细胞增殖抑制率=(OD对照组-OD剂量组)/OD对照组×100.00%。

1.2.4细胞周期分布 利用流式细胞仪检测各组细胞培养72 h的细胞周期分布情况。按照1×106个/ml细胞浓度接种于100 mm培养皿中培养24 h。终止培养，收集原培养液，利用PBS缓冲液冲洗，置入离心管中。按照1 000 r/min转速离心5 min，撇去上清液，预冷后再次离心分离，去除PBS缓冲液和细胞碎片。再次预冷，加入3.5 ml无水乙醇并混合均匀，固定30 min。离心分离，吸出乙醇，加入PBS缓冲液清洗，离心分离去除残留细胞的乙醇。吸去离心管中的PBS，加入PBS缓冲液和RNA酶，孵育30 min(37℃)。避光染色，过滤并标记EP管。开机并利用细胞分选系统检测细胞周期分布情况。

1.2.5JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达检测 利用RT-PCR检测。收集各组培养72 h后的细胞，利用试剂盒提取沉淀细胞中的核糖核酸(RNA)，反转录扩增，并对互补的脱氧核糖核酸进行定量检测，实施PCR扩增反应，反应体系包含：12.5 μl 2×qPCR Mix+2 μl 7.5 μM引物+2.5 μl互补的脱氧核糖核酸+8 μl ddH2O。其中JAK2 上游引物：5′-TCTGAGTACGTCTGTAGCGCTATCAGT-3′；下游引物：5′-ATCGGTGTAAGCTCGCTATGTACTCAG-3′；STAT3上游引物：5′-ACTCGATCGTCGGACGACAACGTCTA-3′；下游引物：5′-CTGGATGTCCTATCGACGGTCGTCATA-3′；β-actin：上游引物：5′-AGTCTATTATTACCCGATGGCCTATGAC-3′；下游引物：5′-TGTACACGTAGTAAATCGTCTGTAGTAC-3′。反应条件：95℃预变性300 s，95℃变性60 s，60℃退火40 s，55℃延伸120 s，溶解曲线75℃-95℃每20 s升温1℃，以β-actin为内参，目的基因相对表达强度为2-△△CT。

1.2.6JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达检测 收集培养72 h后的各组细胞并利用试剂盒提取总蛋白，采用BCA进行定量。每孔上样量为20 μl，进行电泳分离，装配三明治后进行转膜处理，时间为1.5 h。然后利用脱脂奶粉摇床封闭24 h，温度为4℃。加入一抗(放大倍数：1∶1000)后室温下摇床孵育，时间为2 h，洗涤后滴加二抗(放大倍数：1∶10000)，室温下摇床孵育，时间为1 h，在暗室中显色，并对灰度值进行分析。以所检测蛋白的灰度值与内参灰度值的比值描述蛋白相对表达量，其中内参为β-actin。

1.3 观察指标

①对比各组细胞形态学变化；②对比各组培养24 h、48 h和72 h增殖抑制率变化；③对比培养72 h后各组细胞周期分布结果；④对比培养72 h后各组JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达；⑤对比培养72 h后各组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 各组细胞形态学变化

在透射电镜下检查发现对照组各时刻均表现出细胞形态结构规则、染色质均匀分布、细胞膜完整的形态，低中高剂量组出现典型的核固缩、染色质无规律分布、边界不清或染色质集中于核膜且呈新月状，细胞膜不完整等。其中高剂量组形态学异常最为显著，中剂量组形态学明显异常，低剂量组稍有异常，且均呈时间依赖性。

2.2 各组培养24 h、48 h、72 h增殖抑制率变化对比

各组培养24 h、48 h、72 h增殖抑制率对比差异均有统计学意义(P<0.05)，且均呈时间依赖性和剂量依赖性，本组内每2个时刻、各时刻每2组间增殖抑制率对比差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组培养24 h、48 h、72 h增殖抑制率变化对比

注：与培养24 h比较，aP<0.05；与培养48 h比较，bP<0.05；与低剂量组比较，cP<0.05；与中剂量组比较，dP<0.05。

2.3 培养72 h后各组细胞周期分布结果对比

培养72 h后各组细胞G0/G1期、G2/M期结果对比差异均有统计学意义(P<0.05)，其中对照组G0/G1期最高，低剂量组次之，中剂量组更低，高剂量组最低，高剂量组G2/M期最高，中剂量组次之，低剂量组更低，对照组最低，每2组间对比差异均有统计学意义(P<0.05)；各组细胞S期对比差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 培养72 h后各组细胞周期分布结果对比

注：与对照组比较，aP<0.05；与低剂量组比较，bP<0.05；与中剂量组比较，cP<0.05。

2.4 培养72 h后各组JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达对比

培养72 h后各组JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达对比差异均无统计学意义(P<0.05)，每2组间JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达对比差异均无统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 培养72 h后各组JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达对比

2.5 培养72 h后各组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达对比

培养72 h后各组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3对比差异均有统计学意义(P<0.05)，其中对照组p-JAK2、p-STAT3蛋白表达、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3均最高，低剂量组均次之，中剂量组均更低，高剂量组均最低，每2组间对比差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4和图1。

表4 培养72 h后各组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达对比

注：与对照组比较，aP<0.05；与低剂量组比较，bP<0.05；与中剂量组比较，cP<0.05。

图1 各组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达检测结果

3 讨论

卵巢癌的发生与年龄、遗传因素、内分泌紊乱、环境和精神压力等因素均存在紧密的关系，卵巢癌的扩散、转移和复发的基础均是恶性肿瘤细胞增殖，而恶性肿瘤细胞增殖还会影响卵巢癌患者的临床疗效，甚至导致不良预后，危及其生命安全[7,8]。因此采取有效的手段控制卵巢癌细胞增殖是抗卵巢癌治疗的重要任务。手术能够及时切除病灶，但是对于晚期卵巢癌患者并不适用。放化疗也是目前卵巢癌患者常用的治疗手段，但是综合疗效也不佳，并且在抗肿瘤的同时还会造成副作用，安全性不甚理想，故而临床医生应当积极探讨理想的卵巢癌治疗药物以控制细胞增殖，增强疗效并改善预后。

本次研究发现，对照组细胞学形态随着时间的延长无明显变化，均较佳，而3剂量组细胞形态学均有异常改变，呈现剂量依赖性和时间依赖性，可知高剂量3-溴丙酮酸能够促使人卵巢癌细胞株A2780发生形态学变化，为抑制恶性肿瘤细胞的增殖奠定基础。此外，本研究中3剂量组增殖抑制率均随着时间的延长而升高，且高剂量组均最高，中剂量组均稍低，低剂量组均最低，证实3-溴丙酮酸能够有效抑制人卵巢癌细胞株A2780的增殖，且高剂量的效果最佳。另外关于细胞分期的对比结果显示，对照组G0/G1期的构成比均最高，低剂量组均次之，中剂量组均稍低，高剂量组均最低，而G2/M期构成比结果完全相反，提示3-溴丙酮酸能够将恶性肿瘤细胞阻滞于G2/M期，从而发挥抑制人卵巢癌细胞株A2780增殖的作用，且呈现出明显的剂量依赖性。3-溴丙酮酸属于一种强烷化剂，能够抑制己糖激酶II的活性，从而控制恶性肿瘤细胞内的糖酵解，诱导细胞正常生长和增殖所需的能量供应减少，从而导致恶性肿瘤细胞无法正常增殖，增殖抑制率得到提升[9-11]。有研究表明[12]，在缺氧情况下，恶性肿瘤细胞的糖酵解增强，对普通化疗药物的敏感性变差，甚至会产生耐药性，而3-溴丙酮酸的应用能够减少三磷酸腺苷的产生，控制能量供应，抑制多耐药恶性肿瘤细胞的增殖，因此该药物的确具有抗恶性肿瘤细胞增殖的积极作用。

此外，本次研究中各组JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达对比和每2组间表达对比差异均无统计学意义(P>0.05)，关于p-JAK2、p-STAT3蛋白表达、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3的对比结果显示，对照组上述指标水平均最高，低剂量组均次之，中剂量组均更低，高剂量组均最低，可知3-溴丙酮酸能够通过JAK/STAT信号通路下调p-JAK2、p-STAT3蛋白表达，降低p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3水平，且剂量越高对上述基因和蛋白的表达水平控制效果越佳。JAK2属于酪氨酸激酶中Janus家族的一个重要成员，能够介导恶性肿瘤细胞的增殖调控因子、造血和免疫功能的多个细胞因子的生物学活性，在恶性肿瘤细胞中其基因和蛋白表达水平均较高，能够正反馈调控其下游STAT3基因和蛋白的表达，共同参与恶性肿瘤细胞增殖的调控[13,14]。JAK/STAT信号通路是近年来发现参与细胞增殖、分化等多种生物学行为的信号转导通路，由细胞因子产生刺激，影响恶性肿瘤患者的疗效和预后[15]。3-溴丙酮酸对人卵巢癌细胞株A2780增殖的抑制作用已得到证实[16]，但是对JAK/STAT信号通路的调控作用仍未得到证实。目前关于3-溴丙酮酸抑制恶性肿瘤细胞增殖的报道主要显示是通过引起糖酵解，减少能量供应发挥作用的[17-19]。结合本研究结果和上述分析，推测3-溴丙酮酸很可能能够通过调控JAK/STAT信号通路抑制p-JAK2、p-STAT3蛋白表达，下调p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3从而参与促进糖酵解，减少能量供应，诱导细胞增殖受抑制的，但是具体作用机制仍有待进一步研究证实。

综上所述，3-溴丙酮酸能够有效促使人卵巢癌细胞株A2780细胞形态学改变，抑制增殖，且呈明显的剂量依赖性，推测该药物很可能能够通过调控JAK/STAT信号通路抑制p-JAK2、p-STAT3蛋白表达，下调p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3发挥抑制恶性肿瘤细胞增殖的作用，但是需作为进一步的研究方向。