产酸克雷伯菌新生儿分离株对碳青霉烯类耐药的分子机制

李笃军，冯渐焘,刘真真，刘入华，贾 楠，陈海霞，赵 辉，朱元祺*

(1.烟台业达医院 检验科，山东 烟台264006；2.青岛大学附属医院 检验科，山东 青岛266555；3.青岛大学医学院，山东 青岛266071)

目前，无论是国内还是国外耐药监测数据，都显示对碳青酶烯类耐药的肠杆菌以克雷伯菌属为主[1,8]。其中，克雷伯菌属中又以肺炎克雷伯菌居多，而产酸克雷伯菌报道相对较少。与肺炎克雷伯菌一样，产酸克雷伯菌可引起人体的呼吸、血流、腹腔和中枢神经系统的感染[1，2]。因此，我们对2013年9月-2013年12月分离自新生儿患者的3株碳青霉烯类耐药的产酸克雷伯菌的耐药机制和菌株间的同源性进行研究，为临床治疗和采取感控措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株3株碳青霉烯类耐药产酸克雷伯菌(TJ11-TJ13)是2013年9月-2013年12月分离自新生儿患者的吸痰液。质控标准菌株产酸克雷伯菌ATCC700324和大肠埃希菌ATCC25922及接合试验受体菌EscherichiacoliJ53AziR为本室保存。临床株的鉴定和药敏使用VITEK 2 Compact系统，药敏依据CLSI-2018标准判定结果[3]。医院感染的诊断依据患儿的临床资料和 “医院感染诊断标准(2001年试行)[4]进行。

1.2 设备与试剂PCR扩增仪和脉冲场电泳仪为美国伯乐公司；脉冲场凝胶电泳分子量标准为英格兰Biolabs公司；DNA的地高辛标记试剂为罗氏公司；其他试剂和材料为大连宝生(TaKaRa)生物。

1.3 耐药基因的扩增依据参考文献[5]方法扩增β-内酰胺酶及其他耐药相关基因，并通过产物测序确定基因型。生工生物(上海)工程有限公司完成引物合成和产物测序。

1.4 脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型脉冲场凝胶电泳(PFGE)依据相关文献操作，结果判断依据Tenover规则[6]。多位点序列分型(MLST)参照产酸克雷伯菌网站提供管家基因的引物序列和反应条件进行 (https://pubmlst.org/koxytoca)。

1.5 质粒接合和分型供体菌(产酸克雷伯菌)与受体菌(EscherichiacoliJ53AziR)接合试验和质粒复制子分型(PBRT )按相关文献操作[5]。

1.6 S1核酸酶切质粒和Southern杂交S1核酸酶酶切质粒的脉冲场凝胶电泳和Southern杂交实验按以前文献报道的方法[5]。

2 结果

2.1 产酸克雷伯菌和接合子的药敏及耐药基因结果

菌株药敏显示这3株产酸克雷伯菌除了对氨基糖苷类、喹诺酮类和氨曲南敏感外，对测试的β-内酰胺类抗生素都耐药。另外，供体菌(产酸克雷伯菌TJ11-TJ13)与受体菌(EscherichiacoliJ53AziR)经液相接合获得了接合子(TJC11-TJC13)。PCR扩增和测序表明产酸克雷伯菌与其接合子都携带blaNDM-1、blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4和aac(6′)-Ib-cr耐药基因，且二者显示相似的耐药表型。但是，接合子(TJC11-TJC13)比受体菌(EscherichiacoliJ53AziR)对β-内酰胺类抗生素明显耐药。详见表1-表2。

表1 产酸克雷伯菌临床株、接合子和受体菌的药敏(μg/mL)

表2 产酸克雷伯菌与其接合子携带的耐药基因和接合子的质粒分型

2.2 产酸克雷伯菌的脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型结果

3株产酸克雷伯菌之间的脉冲场凝胶电泳条带数目及位置相同，且多位点序列都属于ST2型。此外，依据医院感染诊断标准，引起患儿的感染都属于医院感染。因此，依据临床资料、菌株分离时间、脉冲场凝胶电泳和多位点序列实验结果，表明携带blaNDM-1基因ST2型产酸克雷伯菌在新生儿中存在医院感染的克隆聚集流行。结果详见图1和表2。

注：M，lambda ladder PFGE marker ；Lane 1-3，产酸克雷伯菌TJ11-TJ13

图1 XbaI酶切产酸克雷伯菌基因组PFGE图

2.3 质粒的S1核酸酶切、Southern杂交和复制子分型结果

S1核酸酶切和Southern杂交显示产酸克雷伯菌携带大小约100 kb和275 kb两个质粒，而接合子仅携带约275 kb质粒，且两者携带的blaNDM-1基因都位于275 kb 的质粒上。另外，基于PCR的质粒复制子分型表明接合子携带IncHIB型质粒。详见图2。

3 讨论

近几年来，由于碳青霉烯类抗菌药物暴露的增加和/或不合理的应用，全国许多省市对碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌的分离率明显增加[1]，甚至有的地区碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯杆菌分离率超过30%，这使临床治疗面临很大的困难[1,7]。产酸克雷伯菌与肺炎克雷伯菌一样，对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制是产碳青霉烯酶，并可引起人体多部位的感染[7]。

注：图(A)：M，lambda ladder PFGE marker；Lane 1，S1核酸酶切的产酸克雷伯菌TJ11；Lane 2，S1核酸酶切的接合子TJC11；图(B)：Lane 3，产酸克雷伯菌TJ11的 Southern杂交；Lane 4，接合子TJC11的Southern杂交

图2 质粒的S1核酸酶切PFGE和Southern杂交图

在编码产碳青霉烯酶的产酸肺炎克雷伯菌中，目前已报道的有VIM-1[8],VIM-2[9]，VIM-4[10]，KPC-2[7，11,12]、NDM-1[12]和IMP[7,12,13]等基因型。西班牙学者Pérez的一项研究[8]显示，在80株碳青霉烯类耐药的产酸克雷伯菌中，60% (48/80) 为VIM-1型,37.5% (30/80) 为OXA-48,3.7% (30/80) 为 KPC-2,2.5% (30/80) 为KPC-3,仅1.2% (30/80)属于NDM-1型基因。国内徐小红等报道[7]，在5株耐碳青霉烯类产酸克雷伯菌中，仅有两株分别检出IMP-4，KPC-2和IMP-8。但是，我们研究表明这3株产酸克雷伯菌均携带blaNDM-1基因，同时还携带多个其他耐药基因，如blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4和aac(6′)-Ib-cr耐药基因。Pérez的研究还显示，碳青霉烯酶耐药基因位于IncL,IncHI2,IncFII,IncN,IncC和 IncP6型质粒上，而本研究的blaNDM-1基因位于大小约275 kb的IncHIB型质粒上。另外，在Pérez的研究中，12株经全基因组测序的产酸克雷伯菌显示大部分菌株的多位点序列为ST2型，这一点本文研究与其相一致。

对于碳青酶烯类耐药产酸克雷伯菌，国内外报道往往这些菌对其他类抗生素也同时耐药[7,8]。但是，这3株产酸克雷伯菌除了对大部分β-内酰胺类抗生素耐药外，呈现出对氨基糖苷类、喹诺酮类敏感的药敏表型,具体原因可能与各个地区差异等因素有关，有待进一步研究。

产酸克雷伯菌无论是对碳青霉烯类耐药株还是敏感株，都可引起成人或新生儿的医院感染暴发[14,15]。导致暴发的原因除了患者自身的因素外，常与侵入性操作或周围环境污染定植等因素有关。国内韩志伟报道[16]一起由产酸克雷伯菌引起中心静脉置管后菌血症的感染。Lowe则报道由于洗手池污染产超光谱β-内酰胺酶产酸克雷伯菌而导致的医院感染暴发[16]。由于本研究是回顾性，未能找到引起克隆聚集的具体原因。

总之，我们的研究表明，对碳青酶烯类耐药的ST2型产酸克雷伯菌的耐药机制是与其携带blaNDM-1、blaOXA-1、blaDHA-1、qnrB4和aac(6′)-Ib-cr耐药基因有关，而且在2013年9月-2013年12月期间，新生儿中存在该克隆株的播散。因此，要引起临床重视，并加强各个环节的感控制措施。