多种Cas12a蛋白变体能识别不同的PAM序列（2020.4.27 Plant Biotechnology Journal）

CRISPR/Cas系统能够直接用于基因组编辑、基因调控和其他各种应用。一方面，是由于其效应核酸内切酶的可编程性;另一方面，是由于具有不同特性的Cas核酸酶的不断发现，具体体现在不同的靶向性（DNA或RNA）、不同的PAM识别谱、不同的最佳温度和能够降低脱靶倾向等特点的Cas核酸酶的发现。因此，大量的工作集中在扩大已知的CRISPR-Cas亚型的数量，以识别具有新特性的核酸酶。然而，新出现的证据表明，在每个亚型中，也存在着令人难以置信的多样性。我们却对它们知之甚少。

Cas12a（也称为Cpf1）核酸酶是V-A亚型CRISPR/Cas系统的典型代表，与其他已知的Cas核酸酶相比，Cas12a核酸酶具有独特的性质。具体表现在将转录的CRISPR序列加工形成gRNA的过程中，不需要辅助因子（如：tracrRNA）;识别富含T的PAM序列;利用一个RuvC核酸内切酶结构域切割两条目标DNA链;能非特异性的识别位于靶位点上的单链DNA。

近日，北卡罗莱纳州立大学的Chase L. Beisel研究团队，在Nucleic Acids Research上在线发表题为“Characterization of Cas12a nucleases reveals diverse PAM profles between closely-related orthologs ”的研究论文，揭示了选择压力促使Cas12a识别的PAM序列的多样化，即使是同源的CRISPR核酸酶之间和变构体之间也具有不同的特性，拓展了可用于CRISPR技术的核酸酶种类。

本研究系统描述了6个Cas12a核酸酶的特征，包括彼此之间具有高度相似性或具有良好的核酸酶的核酸酶。发现6个Cas12a核酸酶能够处理和利用彼此的gRNAs进行DNA靶向，尽管它们在明显的DNA裂解活动和PAM偏好上存在差异，且与它们的系统发育关系无关。进一步研究来自Prevotella ihumii （PiCas12a）和Prevotella disiens（PdCas12a）的两个Cas12a核酸酶发现，尽管它们具有95.7%的同源性，但它们识别的PAM谱却惊人地不同。此外，将PiCas12a突变为PdCas12a，可以发现PAM的识别谱与PiCas12a或PdCas12a相关的识別谱之间存在差异。

值得注意的是本研究主要的研究手段是利用无细胞的TXTL检测系统来进行PAM识别谱的鉴定。该系统利用商业化的Escherichia coli的裂解液，快速的表达Cas12a蛋白，同时，构建N5 PAM的库与相应的靶标gRNA，将其混合在29°C的条件下孵育16小时，后建库并通过二代测序技术，确定N5 PAM被切割的情况，最终确定特定物种的Cas12a蛋白的PAM识别谱。