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多种Cas12a蛋白变体能识别不同的PAM序列(2020.4.27 Plant Biotechnology Journal)

2020-05-13

三农资讯半月报 2020年8期
关键词:亚型靶向核酸

CRISPR/Cas系统能够直接用于基因组编辑、基因调控和其他各种应用。一方面,是由于其效应核酸内切酶的可编程性;另一方面,是由于具有不同特性的Cas核酸酶的不断发现,具体体现在不同的靶向性(DNA或RNA)、不同的PAM识别谱、不同的最佳温度和能够降低脱靶倾向等特点的Cas核酸酶的发现。因此,大量的工作集中在扩大已知的CRISPR-Cas亚型的数量,以识别具有新特性的核酸酶。然而,新出现的证据表明,在每个亚型中,也存在着令人难以置信的多样性。我们却对它们知之甚少。

Cas12a(也称为Cpf1)核酸酶是V-A亚型CRISPR/Cas系统的典型代表,与其他已知的Cas核酸酶相比,Cas12a核酸酶具有独特的性质。具体表现在将转录的CRISPR序列加工形成gRNA的过程中,不需要辅助因子(如:tracrRNA);识别富含T的PAM序列;利用一个RuvC核酸内切酶结构域切割两条目标DNA链;能非特异性的识别位于靶位点上的单链DNA。

近日,北卡罗莱纳州立大学的Chase L. Beisel研究团队,在Nucleic Acids Research上在线发表题为“Characterization of Cas12a nucleases reveals diverse PAM profles between closely-related orthologs ”的研究论文,揭示了选择压力促使Cas12a识别的PAM序列的多样化,即使是同源的CRISPR核酸酶之间和变构体之间也具有不同的特性,拓展了可用于CRISPR技术的核酸酶种类。

本研究系统描述了6个Cas12a核酸酶的特征,包括彼此之间具有高度相似性或具有良好的核酸酶的核酸酶。发现6个Cas12a核酸酶能够处理和利用彼此的gRNAs进行DNA靶向,尽管它们在明显的DNA裂解活动和PAM偏好上存在差异,且与它们的系统发育关系无关。进一步研究来自Prevotella ihumii (PiCas12a)和Prevotella disiens(PdCas12a)的两个Cas12a核酸酶发现,尽管它们具有95.7%的同源性,但它们识别的PAM谱却惊人地不同。此外,将PiCas12a突变为PdCas12a,可以发现PAM的识别谱与PiCas12a或PdCas12a相关的识別谱之间存在差异。

值得注意的是本研究主要的研究手段是利用无细胞的TXTL检测系统来进行PAM识别谱的鉴定。该系统利用商业化的Escherichia coli的裂解液,快速的表达Cas12a蛋白,同时,构建N5 PAM的库与相应的靶标gRNA,将其混合在29°C的条件下孵育16小时,后建库并通过二代测序技术,确定N5 PAM被切割的情况,最终确定特定物种的Cas12a蛋白的PAM识别谱。

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