地萸补肾固冲方对未成年雌性大鼠卵巢组织中FSHR和LHR的影响*

刘方洲，张雪侠，郭晓燕，李士瑾

(河南省中医药研究院，河南 郑州450004)

青春期功血属无排卵性功血，属子宫异常出血的范畴[1],虽有成批的卵泡形成，却无排卵出现，进而引起子宫的异常出血[2]。青春期功血大多发生在少女初潮的前两年，无排卵型及无黄体形成者占55%～75%[3]，其中无排卵性青春期功血在发生初期症状就比较严重。目前，青春期功血是一个较难彻底治愈的妇科疾病。地萸补肾固冲方是临床经验方，由党参、炒白术、生白芍、菟丝子、生山药、旱莲草、淫羊藿、山萸肉、川续断、阿胶(烊化)、生地黄、鸡内金、熟地黄组成，对性腺轴具有调节作用[4]。本实验观察了地萸补肾固冲方对未成年雌性大鼠卵巢组织中促卵泡生成素受体(FSHR)和黄体生成素受体(LHR)的影响，以期对其的作用机制进行更深一步的探讨。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级未成年雌性Wistar大鼠50只，21 d龄，体质量50～70 g，由山东省济南朋悦实验动物繁育有限公司提供,合格证号为37009200005897，实验单位使用许可证号为SYXK(豫)2012-0009。

1.2 药品、试剂与仪器

地萸补肾固冲方组成：党参15 g，炒白术15 g，生白芍15 g，菟丝子20 g，淫羊藿20 g，生山药30 g，旱莲草20 g，山萸肉15 g，川续断12 g，阿胶(烊化)12 g，生地黄6 g，鸡内金9 g，熟地黄20 g。药液由河南省中医药研究院制剂室制备。将药材按照1∶2与去离子水混合，静置浸泡，然后倒入高压提取罐内进行提取，浓缩为质量分数为1.5 g/mL溶液，高温消毒，置于4 ℃冰箱保存，用时临时配制合适的质量分数。己烯雌酚片，0.5 mg/片，合肥久联制药有限公司产品，批号20181013；水合氯醛，天津市科密欧化学试剂有限公司产品，批号20180922；促卵泡生成素(FSH)、黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、睾酮(TT)、游离睾酮(FT)、促性腺激素释放激素(GnRH)ELISA试剂盒，均购自苏州卡尔文生物科技有限公司，批号E20181225A；促卵泡生成素受体(FSHR)和黄体生成素受体(LHR)免疫组化试剂盒，购自武汉博欧特生物科技有限公司，批号20190122；9 g/L氯化钠注射液，四川科伦药业股份有限公司产品,批号C119011104-1；去离子水，河南省奥林特药厂提供。JSB30-1电子天平,上海浦春剂量仪器有限公司产品；LD4-2A离心机，北京医用离心机厂产品；SYNERGY NEO多功能微孔板检测仪，BioTek Instruments,Inc产品；CX31型奥林巴斯显微镜，产地日本；10 mL一次性使用无菌注射器，上海康德莱企业发展集团股份有限公司产品。

1.3 动物分组与给药

将大鼠随机分为正常对照组，己烯雌酚组，地萸补肾固冲方高、中、低剂量组5组，每组10只。正常对照组给予生理盐水灌胃；己烯雌酚组给予己烯雌酚混悬液0.067μg/g (按临床剂量的6.7倍) 灌胃；地萸补肾固冲方高、中、低剂量组分别给地萸补肾固冲方浸膏稀释液30，15，7.5 g/kg(以生药量计) 灌胃，分别相当于临床剂量的6.7，3.35，1.68倍。各组均按20 μL/g给药，1 d 1次，连续给药4周。

1.4 检测指标与方法

末次给药后，以质量分数为100 g/L的水合氯醛麻醉，取血、卵巢以备用。

1.4.1 血清中E2、LH、TT、FSH、P、FT、GnRH水平

采用ELISA法检测。将大鼠血液在4 ℃下以3 000 r/min 离心10 min分离出血清，检测血清中E2、LH、TT、FSH、P、FT、GnRH水平。操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.4.2 卵巢组织中FSHR、LHR的表达

采用免疫组化法检测。称量卵巢质量，用质量分数为40 g/L的多聚甲醛固定，常规制片，厚约5 mm，进行免疫组化染色程序后封片，运用Image J软件进行定量分析卵巢组织中FSHR、LHR的表达情况。

1.5 统计学方法

2结 果

2.1 各组大鼠血清E2、LH、TT、FSH、P、FT、GnRH水平

与正常对照组对比，己烯雌酚组中大鼠血清的E2、LH、FSH、P、GnRH含量有统计学意义(P<0.05)；地萸补肾固冲方高剂量组中血清的E2、P、LH含量有统计学意义(P<0.05)；地萸补肾固冲方中、低剂量组血清的各项指标有升高的趋势，但无统计学意义(P>0.05 )。结果表明：地萸补肾固冲方可以在一定程度上调节大鼠体内的激素水平。见表1。

表1 各组大鼠血清E2、LH、TT、FSH、P、FT、GnRH水平对比

组 别nE2LHTTFSH正常对照组104.46±1.762.51±1.811.33±0.431.64±0.54己烯雌酚组96.03±1.19∗3.70±0.45∗1.95±1.022.63±0.62∗地萸补肾固冲方高剂量组106.12±1.14∗3.66±0.74∗1.41±0.442.20±0.88地萸补肾固冲方中剂量组95.21±0.812.76±0.531.30±0.321.97±0.31地萸补肾固冲方低剂量组94.80±0.602.92±0.441.01±0.541.82±0.44组 别nPFTGnRH正常对照组102.49±0.480.12±0.0520.60±1.08己烯雌酚组93.29±0.97∗0.19±0.1323.05±2.62∗地萸补肾固冲方高剂量组103.11±0.57∗0.19±0.2421.20±0.77地萸补肾固冲方中剂量组92.56±0.560.20±0.3221.43±1.08地萸补肾固冲方低剂量组92.69±0.430.12±0.0721.32±0.74

注：与正常对照组对比，*P<0.05。己烯雌酚组，地萸补肾固冲方中、低剂量组各有1只大鼠因灌胃原因死亡。

2.2 各组大鼠卵巢组织中FSHR表达对比

光镜下，可见FSHR蛋白不同程度地表达于正常对照组、己烯雌酚组、地萸补肾固冲方高、中、低剂量组卵巢的颗粒细胞中。见图1。

正常对照组：卵巢组织结构完整，颗粒细胞中可见大量的棕黄色颗粒的表达

己烯雌酚组：卵巢的颗粒细胞中有大量的棕黄色颗粒的表达

地萸补肾固冲方高剂量组：卵巢的颗粒细胞中有大量的棕黄色颗粒的表达

地萸补肾固冲方中剂量组：卵巢的颗粒细胞中有大量的棕黄色颗粒的表达

地萸补肾固冲方低剂量组：卵巢的颗粒细胞中有少量棕黄色颗粒的表达

图像分析结果显示：正常对照组卵巢组织中FSHR蛋白表达程度显著低于己烯雌酚组、地萸补肾固冲方高剂量组，差别有统计学意义(P<0.05)。地萸补肾固冲方中、低剂量组中FSHR蛋白表达不同程度地高于正常对照组，但差别无统计学意义。见表2。

组 别nFSHR正常对照组105.405±0.771己烯雌酚组910.325±2.887∗地萸补肾固冲方高剂量组109.134±2.752∗地萸补肾固冲方中剂量组96.145±1.347地萸补肾固冲方低剂量组95.684±1.769

注：与正常对照组对比，*P<0.05。己烯雌酚组，地萸补肾固冲方中、低剂量组各有1只大鼠因灌胃原因死亡。

2.3 各组大鼠卵巢组织中LHR表达对比

光镜下，可见LHR蛋白不同程度地表达于正常对照组，己烯雌酚组，地萸补肾固冲方高、中、低剂量组卵巢的卵泡膜细胞中。见图2。

正常对照组：卵巢组织结构完整，细胞排列整齐，卵泡膜细胞中存在大量的棕黄色颗粒的表达

己烯雌酚组：卵巢的卵泡膜细胞中可见大量的棕黄色颗粒

地萸补肾固冲方高剂量组：卵巢组织结构完整，卵泡膜细胞中存在大量的棕黄色颗粒的表达

地萸补肾固冲方中剂量组：卵巢组织结构完整、卵泡膜细胞中存在大量的棕黄色颗粒的表达

地萸补肾固冲方低剂量组：卵巢的卵泡膜细胞中存在少量的棕黄色颗粒的表达

图像分析结果显示：正常对照组卵巢组织LHR蛋白表达显著低于己烯雌酚组，差别有统计学意义(P<0.05);地萸补肾固冲方高、中剂量组卵巢组织LHR表达不同程度地高于正常对照组，但差别无统计学意义。见表3。

组 别nLHR正常对照组104.598±1.334己烯雌酚组98.335±1.205∗地萸补肾固冲方高剂量组105.558±2.249地萸补肾固冲方中剂量组94.834±1.906地萸补肾固冲方低剂量组94.331±1.522

注：与正常对照组比：*P<0.05。乙烯雌酚组，地萸补肾固冲中、低剂量组各有1只大鼠因灌胃原因死亡。

3 讨 论

对于青春期功血，西医学大多采用促排卵药物治疗，但使用促排卵药物的女性发生交界性卵巢肿瘤的可能性是未用药女性的4倍[5]。有研究[6]表明：补肾中药对青春期功血患者血清中激素的水平具有较好的调节作用，对月经正常周期的恢复有促进作用。也有研究表明，无排卵型功血子宫内膜具有高水平的雌激素受体[7]，通过促进子宫局部子宫组织雌激素受体(ER)mRNA和孕激素受体(PR)mRNA的表达来实现对异常子宫出血的止血目的[8]。FSHR和LHR是卵巢颗粒细胞膜表面的重要受体，2者能够分别与卵泡刺激素和黄体生成素结合，促进卵泡的发育与排出，两者的表达水平与细胞的成熟程度呈现正相关[9]。这也就意味着可以通过药物促进这两个受体与相应激素结合以促进卵巢的发育，从而达到治疗青春期功血的目的。中药对雌激素、孕激素及其受体，以及子宫内膜血管生成及修复都有一定的影响。王慧颖等[10]的研究表明,宫血饮能够降低无排卵型功血患者子宫内膜的ER及PR，但对E2水平影响不大。张树成等[11]的研究表明,补肾调经中药能明显增强子宫组织的血管生成。付灵梅等[12]通过动物实验证明具有益气化瘀作用的环血宁汤对置铜宫内节育器家兔子宫内膜的损伤有一定的修复作用，提示环血宁可能通过促进子宫内膜的修复而起到治疗置宫内节育器后子宫异常出血的作用。

地萸补肾固冲方中熟地黄、阿胶、山萸肉为君药，有补肾益精、固冲止血的效果；党参、生山药、炒白术、川续断、菟丝子、淫羊藿和旱莲草为臣药，助君药补肾填精止血[13-19]；生白芍[20]、生地黄为佐药，生白芍能养血和营，助熟地黄滋养心肝；鸡内金为使药，使全方滋补而不刺激胃，补而不滞，又有化瘀之功。全方体现出了塞流与澄源并用、固本及治标相结合的特点，固摄止血的同时又兼顾活血，使血止而不留瘀。该方在补肾的同时又兼顾到脾肝，补肾健脾柔肝，使肾精充盛，天癸成熟，这也是该方的一大特点。本实验显示：地萸补肾固冲方对性激素有一定的调节作用，对卵巢组织FSHR、LHR的表达有一定的促进作用，故而推测其对青春期功血的调节作用可能与其调节卵巢组织的FSHR、LHR有关。

综上所述，地萸补肾固冲方从补肾固冲出发，通过促进未成年雌性大鼠卵巢中FSHR、LHR的表达，使FSH、LH作用增强。FSH可刺激卵泡的生长发育，LH可促进排卵，从而促进未成年雌性幼鼠性腺轴发育，达到治疗青春期功血的作用。本研究从地萸补肾固冲方对卵巢组织相关蛋白的影响入手，探索其药理药效基础研究，为青春期功血的治疗提供一种新的思路与方法。