ERG11基因与热带念珠菌唑类药物耐药关系的研究

王影 项明洁 刘锦燕 叶书来 周馨

(1.中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)检验科，合肥 230036；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025；3.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科，上海 200020)

念珠菌(Candidaspp.)是临床上真菌感染的主要致病菌。近年来，随着器官移植、肿瘤放化疗、大剂量广谱抗生素的长期应用，糖皮质激素、免疫抑制剂的广泛应用及临床预防性或过量抗真菌药物的应用等因素[1, 2]，临床真菌感染问题日趋严重，可导致口腔、上呼吸道、阴道黏膜及全身系统性侵袭性感染(invasive fungual infection，IFI)。其中侵袭性真菌感染预后差，病死率高，已成为一个重要的公共卫生问题[1]。虽然在临床念珠菌的感染中白念珠菌最常见，但是由非白念珠菌(non-albicansCandida，NAC)引起的感染，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势[3]，其中，以热带念珠菌较常见[2, 4]。研究显示，热带念珠菌已成为住院患者血流和尿路真菌感染的重要病原体[5]。抗真菌药物中三唑类药物，尤其是氟康唑因抗菌谱广、疗效显著、生物利用度高和毒副作用低等优点，常作为临床一线用药[6, 7]，但由于唑类药物仅具有抑菌而非杀菌效果，在临床长期、反复用药过程中易导致耐药发生，使得临床治疗变得棘手[1, 8]。

热带念珠菌耐药机制至今仍不太明确，有研究报道热带念珠菌唑类药物的耐药与ERG11基因有关。ERG11基因的编码产物14α-去甲基化酶(14α-demethylase，14-DM)为念珠菌细胞膜麦角固醇合成通路中关键酶，是唑类药物的作用靶酶[9]。本研究旨探讨临床唑类药物耐药热带念珠菌ERG11基因的改变。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株来源 本研究所用的临床热带念珠菌均来自于瑞金医院2012年至2015年的住院及门急诊的患者。

仪器与试剂 VITEK2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统(法国梅里埃公司)；实时荧光定量PCR分析仪(ABI 7300，美国)； Tanon EPS-300 水平式电泳仪和Tanon 凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；PCR仪(S100TMThermal Cycler PCR，Bio-Rad 美国)；YPD 培养基(上海博微生物科技有限公司)；Ex Taq 酶(TaKaRa 公司)；DNA Marker DL2000 (TaKaRa 公司)；酵母菌RNA抽提试剂盒、PrimeScriptTM反转录试剂盒及SYBR©Premix Ex TaqTMRT-PCR扩增试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，本研究所用引物由生工生物工程有限公司进行合成。

1.2 方法

菌株鉴定 -80℃ 25%甘油冻存的临床菌株接种于科玛嘉酵母菌显色平板，于35℃培养24～48 h后，热带念珠菌呈深蓝绿色。再用VITEK2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统对临床分离的菌株进行进一步鉴定。将最终鉴定成功的菌落取单克隆增菌培养后，置于-80 ℃ 25%甘油培养液中冻存待用。

药敏 以白念珠菌ATCC 90028为阴性对照，克柔念珠菌ATCC 6258为阳性对照，采用微量肉汤稀释法检测菌株的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。具体检测方法按照美国临床实验室标准化协会(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M27-A3方案进行。

DNA提取 热带念珠菌经YPD 培养基35 ℃培养过夜， 收集菌体，加酵母菌裂解液(10%SDS、0.5 mmol/L pH 8.0 EDTA 蛋白酶K) 后，65 ℃水浴2 h 破壁，用苯酚、氯仿、异戊醇(25∶24∶1)和氯仿各抽提1 次，异丙醇沉淀，后用75%乙醇洗涤，加水溶解，-20 ℃冻存。

ERG11基因测序 由于热带念珠菌ERG11基因编码区全长为1587bp(热带念珠菌标准菌株ATCC750，GenBank数据库编号M23673)，为保证测序结果的准确性，设计3对引物进行基因全长进行测序，具体引物序列见表1。PCR反应体系包括Ex Taq酶0.25 μL，10×Ex buffer 5 μL(含20 mmol/L Mg2+)，dNTPs 4 μL，50 μmol/L的正向和反向引物各0.4 μL，DNA模板(200 ng/μL)1 μL和双蒸水ddH2O 38.95 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性 2 min；94℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72℃ 1 min,共29个循环；72℃延伸5 min。PCR扩增产物与6×loading buffer 混匀后加入1.5%琼脂糖凝胶电泳孔，在Tanon EPS-300水平式电泳仪中电泳20 min，经Tanon凝胶成像系统证实为单一条带后，送生工生物工程有限公司测序，测序引物与扩增引物相同，测序方法为sanger法，由于热带念珠菌为二倍体菌株，所有基因测序均采用正反双向引物同时测序。

表1 ERG11基因扩增及测序引物

实时荧光定量PCR检测 参照酵母菌RNA抽提和反转录试剂盒说明书，对临床热带念珠菌株进行RNA抽提和反转录。按照SYBR©Premix Ex TaqTMRT-PCR扩增试剂盒说明书配制RT-PCR反应体系，引物为ERG11-F和ERG11-R，反应条件为：95 ℃ 2min；95 ℃ 5 s、 60 ℃ 31 s，40 个循环。收集荧光阈值(Cycle threshold，Ct)，以热带念珠菌ACT为内参基因，用相对定量方式计算△Ct (△Ct = CtERG11-CtACT)，各唑类耐药菌株ERG11表达量相对于敏感菌株平均ERG11表达量的倍数即为2-△△Ct(△△Ct=△Ct耐药-△Ct敏感)。每个标本同时检测3次，达到2倍及以上增高为有意义。

2 结 果

对临床连续收集的92株热带念珠菌进行药敏检测，氟康唑，伊曲康唑和伏立康唑的耐药折点分别为培养24 h后≥8 mg/L, ≥1 mg/L 及≥1 mg/L，结果显示有29株临床菌株对至少一种唑类药物耐药(见表2)，耐药率为31.52%。ERG11基因测序结果显示，40株临床菌株，共发现2个错义突变(S154F、Y132F)，5个同义突变。其中，29株唑类药物耐药菌株中有24株(82.76%)同时出现错义突变S154F、Y132F，而11株唑类药物敏感菌株无错义突变出现。以热带念珠菌ACT为内参基因，实时荧光定量PCR结果显示(见图1)，与唑类药物敏感菌株ERG11基因平均表达量相比，29株唑类药物耐药菌株中有19株ERG11基因表达量上调两倍以上。 分析16株唑类药物全耐药菌株及其余13株仅对一种或两种药物耐药菌株的ERG11表达水平，显示前者ERG11基因表达水平高于后者，差异有统计学意义(P=0.016<0.05)，见图2。

3 讨 论

热带念珠菌是一种临床常见的条件致病性真菌，其临床治疗的主要药物为三唑类药物，如氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑。近年来，热带念珠菌耐唑类药物的报道日渐增多，但其耐药机制仍不甚明确[1]。少量已报道的对热带念珠菌耐药机制的研究主要是依据白念珠菌及光滑念珠菌唑类药物耐药的分子机制，如多药耐药蛋白(multidrug resistant protein, MRP)表达增加；唑类药物作用靶酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51A1)表达增加或结构改变；菌株生物膜形成及细胞代谢应激反应等。有研究显示[10-12]，临床热带念珠菌对唑类药物的耐药可能与ERG11基因突变及过表达有关而与多药耐药蛋白无关。也有研究认为热带念珠菌耐药受MDR1基因过表达及ERG11的突变两种机制共同调控[13]。

ERG11基因编码产物羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51A1)为唑类药物抗真菌作用靶酶，其基因突变与多种真菌唑类药物耐药相关，如白念珠菌[14]、近平滑念珠菌[15]、新生隐球菌[16]等。本研究共收集92株临床热带念珠菌，其中有29株对至少一种唑类药物耐药，耐药率高达31.52%。菌株ERG11基因测序显示，24株耐药菌株同时出现S154F、Y132F错义突变，推测可能是这两种错义突变产生了协同效应，使ERG11基因编码产物，即药物作用靶酶产生明显改变，进一步降低药物与靶酶的亲和力。值得注意的是CaERG11基因的Y132H/F错义突与白念珠菌唑类药物耐药有关[14]，CpERG11基因Y132F氨基酸置换与近平滑念珠菌唑类耐药相关[15,17]，这说明氨基酸132位点的置换是念珠菌属的热门位点，可能此位点在基因编码过程中产生非常重要的作用[11]。最新研究又发现新的热带念珠菌ERG11基因错义突变K143R、V125A、Y257H及G464S，并证实与唑类药物耐药相关[18,19]。ERG11基因表达量检测结果显示，与唑类药物敏感菌株ERG11基因平均表达量相比，29株药物耐药菌株有19株呈现不同程度的ERG11表达量上调，而且耐药菌株ERG11基因表达量与其唑类药物耐药数量有相关趋势，三种唑类药物全耐药菌株与非全耐药菌株相比，ERG11基因表达水平增高，这与Jiang 等[11]的研究结果较一致。本研究有4株(CT08、CT13、CT16和CT20)唑类药物耐药菌株无ERG11基因错义突变及明显的ERG11基因表达上调，这说明还有其他耐药机制参与菌株耐药，这些耐药机制还需在以后的研究中继续探讨。

表2 临床菌株药敏结果及ERG11基因核苷酸和氨基酸突变位点

注：下划线指错义突变位点

图129株唑类药物耐药菌株ERG11基因表达水平图2三种唑类药物全耐药菌株与非全耐药菌株ERG11基因表达水平

Fig.1The expression ofERG11 gene in 29 azole-resistant clinical isolatesFig.2The expression levels ofERG11gene in isolates which were resistant to three azole antifungals and were resistant to only one or two azole antifungals

综上所述，热带念珠菌作为一种临床上分离率高，且近几年唑类药物耐药率逐渐上升的条件致病菌, 国内对其研究程度远低于白念珠菌, 我们应在后续的研究中对其予以重视，阐明其耐药机制，为临床治疗及新药研发提供思路。