85株皮肤癣菌感染的病原菌分析及标准化体外药物敏感性研究

刘洁 刘晓云 于波 胡小平

(北京大学深圳医院皮肤性病科，深圳 518036)

皮肤癣菌是最常见的引起头癣、体癣、手足癣等浅部真菌感染的丝状真菌，在免疫受损的患者甚至可导致深部感染[1]。临床上治疗皮肤癣菌感染的药物主要包括烯丙胺类、唑类、环丙酮类和多烯类等。本研究旨在精确分析本地区皮肤癣菌感染的病原菌特点，采用标准化的药敏方案测定体外药物敏感性，以期为临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象与菌株分离鉴定

2018年6月～2019年1月在北京大学深圳医院皮肤科就诊的患者，入组标准为临床表现符合体癣、股癣、手足癣、甲癣、头癣等特征，采样前3个月患者未接受过局部或全身抗真菌治疗，共纳入161例疑似皮肤癣菌感染的患者。对入组的161例患者的皮肤刮屑(或甲板刮屑、毛发)同时做KOH涂片直接镜检和真菌分离培养。共有109例患者在皮肤刮屑(或甲板刮屑、毛发)中检出透明分隔的关节菌丝或关节孢子(皮肤癣菌镜检阳性率67.7%)。真菌分离培养皮肤刮屑(或甲板刮屑、毛发)接种于含放线菌酮150 μg·mL-1的沙堡弱葡萄糖琼脂培养基(sabouraud dextrose agar, SDA)置于28℃生化培养箱培养观察4周。在109例KOH直接镜检皮肤癣菌为阳性的标本培养出85例皮肤癣菌，6例念珠菌等酵母样菌落，2例青霉；在52例KOH直接镜检阴性的标本培养出7例念珠菌等酵母样菌落，5例青霉，1例曲霉。余培养未见真菌生长。

分子生物学方法为利用通用引物扩增测序内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)鉴定85例培养阳性的皮肤癣菌。将受试菌株置于SDA培养基28℃生化培养箱孵育7 d，使用Biospin真菌全基因组DNA试剂盒(博日科技有限公司)提取全基因组DNA。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增核糖体的ITS基因序列，引物为真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR体系包括约80 ng的DNA模板，2XTaqPCR GreenMix 25 μL(天根生化科技有限公司)，10 μmol·L-1上下游引物各2 μL，ddH2O补至50 μL。扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃后延伸5 min。PCR产物送广州艾基生物技术有限公司进行产物纯化和基因测序。各菌株序列区段在荷兰皇家科学院CBS真菌生物多样性研究中心网站(http://www.cbs.knaw.nl/dermatophytes/)进行比对，依据目前比较公认的ITS区基因序列中碱基比对相似性大于98%判定其为同一菌种进行鉴定[2]。并以CBS数据库中已确证分类的皮肤癣菌标准菌株的ITS区序列作为参考序列。

1.2 体外药物敏感性测定

受试菌株为经过形态学和分子生物学鉴定得到的85株皮肤癣菌，质控菌株为近平滑念珠菌ATCC-22019和趾间毛癣菌ATCC-MYA-4439(均购自广东省微生物菌种保藏中心)。药敏测定药物均以原料粉形式由大连美仑生物技术有限公司提供，两性霉素B(批号00620A，纯度>75%)；伊曲康唑(批号N0803A，纯度>99%)；氟康唑 (批号M0801A ,纯度为>98.5% )；特比萘芬(批号D0102A，纯度>98.5%)；环吡酮胺(批号M0523A，纯度>99%)；酮康唑(批号J0620AS，纯度>99%)；伏立康唑(批号S0601A，纯度>99%)。参照美国临床和实验室标准研究所(clinical and laboratory standards institute, CLSI)制定的M38-A2方案进行。按照CLSI方案采用RPMI-1640液体培养基。

药物储存液制备与储存 将抗真菌药物按照溶解性分别采用二甲基亚砜(DMSO)或蒸馏水溶解，获得相应浓度(包括各药的折点和质控菌株对该药物MIC范围)的储存液。新鲜配制的储存液分装到无菌的聚丙乙烯小管，密封储存于-80℃。

药敏板配制 实验前采用相应液体培养基稀释至2倍终浓度工作液。特比萘芬和伏立康唑的最终浓度为0.001～0.5 μg·mL-1，氟康唑最终浓度范围为0.125～64 μg·mL-1，环吡酮胺最终浓度为0.015～8 μg·mL-1，两性霉素B、伊曲康唑和酮康唑最终浓度为0.03～16 μg·mL-1。将稀释的药物按照浓度由高到低依次加入微量药敏板(96孔酶标板)1～10列中，每孔100 μL，第11、12列分别加入100 μL、200 μL相应液体培养基，分别作为生长对照和空白对照，-20℃保存备用。

菌悬液制备及接种 将受试临床分离菌株转种于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基于28℃生化培养箱中培养7 d，用无菌生理盐水洗脱纯化的菌落，制成菌悬液，使用血细胞计数板调整菌悬液终浓度至(1～5)×103CFU·mL-1，将此浓度菌悬液1至11列每孔各加入100 μL。

孵育与结果判读 将接种后的药敏培养板35℃培养4～5 d后观察结果。目前国内对丝状真菌的药敏试验主要参考CLSI M38-A2方案，皮肤癣菌体外药敏尚无临床折点或流行病学临界值进行分析，因此本研究仅读取和比较测试药物对皮肤癣菌的MIC值。两性霉素B的MIC判读标准为与生长对照相比无任何肉眼可辨生长(100%受抑)的最低药物浓度；唑类药物、环吡酮胺和特比萘芬 MIC判读标准为与生长对照相比生长明显抑制(80%受抑)的最低药物浓度。所有试验均重复2次。

1.3 统计学分析与处理

记录抗真菌药物对受试菌株的MIC值，计算MIC范围，MIC几何均数(geometric mean MIC, GM MIC)，MIC90和MIC50。

2 结 果

2.1 临床资料

161例疑似皮肤癣菌感染的患者中有109例行KOH涂片直接镜检在皮肤刮屑(或甲板刮屑、毛发)标本中检出透明分隔的关节菌丝或关节孢子(镜检阳性率为67.7%)。患者患病部位和年龄性别分布情况见表1，包括男性61例(55.3%)，女性48例(44.7%)，年龄范围1～65岁，平均年龄为31.5岁。161例疑诊为皮肤癣菌感染的患者的皮肤刮屑(或甲板刮屑、毛发)标本在SDA培养基28℃生化培养箱中培养4周。在109例KOH直接镜检为阳性的标本培养出85例皮肤癣菌(培养阳性率为52.8%)，6例念珠菌等酵母样菌落，2例青霉，16例未见真菌生长；在52例KOH直接镜检为阴性的标本培养出7例念珠菌等酵母样菌落，5例青霉，1例曲霉，39例未见真菌生长。85例皮肤癣菌培养阳性的菌株运用分子生物学方法进行菌种鉴定的结果(见表2)为68株红色毛癣菌(80%)、7株犬小孢子菌(8.2%)、5株趾间毛癣菌(5.9%)、3株石膏样小孢子菌(3.5%)、紫色毛癣菌(1.2%)和断发毛癣菌(1.2%)各1株。85例皮肤癣菌培养阳性的患者中，红色毛癣菌是引起手足癣、甲癣、股癣和体癣的主要致病菌，犬小孢子菌是引起头癣的主要致病菌。

2.2 体外药物敏感性测定

7种抗真菌药物对6种皮肤癣菌的体外药物敏感性测定结果(见表3)显示，特比萘芬相较于本研究中的其他药物，对红色毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和断发毛癣菌的测定值GM MIC均为最低(分别为0.032 μg·mL-1、 0.040 μg·mL-1、 0.003 μg·mL-1、 0.064 μg·mL-1)。伏立康唑相较于本研究中的其他药物对趾间毛癣菌的体外抑菌浓度值最低(0.040 μg·mL-1)，伊曲康唑和特比萘芬相较于本研究中的其他药物对紫色毛癣菌的体外最低抑菌浓度值均最低(0.030 μg·mL-1)。7种抗真菌药物对分离到的皮肤癣菌临床分离菌株的GM MIC值从低到高依次为：特比萘芬(0.032 μg·mL-1)、伏立康唑(0.041 μg·mL-1)、伊曲康唑(0.370 μg·mL-1)、酮康唑(0.628 μg·mL-1)、环吡酮胺(0.922 μg·mL-1)、两性霉素B(1.763 μg·mL-1)、氟康唑(9.181 μg·mL-1)。

表1109株KOH真菌镜检皮肤癣菌阳性的患者的感染部位、年龄和性别分布 (n)

Tab.1Infection type, age and gender distribution of 109 strains of dermatophytes (n)

部位年龄组性别<3030～50>50男性女性总计体癣710211819股癣79316319手足癣9175161531甲癣13161111930头癣10007310总计4652116148109

表285株皮肤癣菌培养阳性的菌种分布 (n)

Tab.2The distribution of 85isolates of dermatophytes cultured positive (n)

感染类型红色毛癣菌犬小孢子菌石膏样小孢子菌趾间毛癣菌紫色毛癣菌断发毛癣菌总计体癣141100016股癣150000015手足癣180000018甲癣210050026头癣06201110总计687351185

3 讨 论

皮肤癣菌及其主要致病菌种的分布在不同国家和地区具有差异性。皮肤癣菌感染的主要流行菌种有红色毛癣菌、须癣毛癣菌复合体、紫色毛癣菌、絮状表皮癣菌和犬小孢子菌等。国外文献报道利比亚[3]主要流行紫色毛癣菌，伊朗[4-5]和伊拉克[6]主要为絮状表皮癣菌，澳大利亚主要为趾间毛癣菌[7]，而在泰国主要为犬小孢子菌[8]。本研究中，红色毛癣菌是我院皮肤癣菌感染中最主要的菌种，该结果同我国其他地区及国外大多数国家相一致[9-13]。

目前，诊断皮肤癣菌感染主要基于真菌直接镜检和真菌培养。真菌直接镜检是临床上诊断皮肤癣菌感染的重要手段，但其局限性在于无法准确地鉴定菌株。真菌直接镜检的同时还要进行真菌培养，通常是将皮肤刮屑(或甲板刮屑、毛发)接种在添加放线菌酮或氯霉素的SDA培养基上置于28℃生化培养箱进行培养，依据菌落形态、颜色变化及镜下形态等特征判定结果。然而，单纯真菌培养形态学鉴定目前存在诸多问题，包括不能精准地鉴定菌种，培养周期较长，来自多种非皮肤癣菌丝状真菌(non-dermatophyte filamentous fungi, NDF)菌落的干扰(如镰刀菌属、曲霉属、青霉属和链格孢属等)等。因此，近年来多种分子生物学方法用来精准鉴定皮肤癣菌菌种，如使用通用引物PCR扩增测序受试菌株的ITS区并和标准株序列进行比对[2]、使用单项引物(GACA)4的PCR[14]、多重引物PCR(multiplex PCR)[15]、任意引物聚合酶链式反应(arbitrarily primed PCR, AP-PCR)[16]、巢式PCR(nested PCR)[17]、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)[18]和随机扩增多态DNA (randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)[19]等。其中，皮肤癣菌的rDNA是一种串联重复基因，在rDNA各亚基间有高度重复序列的ITS区，ITS序列扩增测序分析是目前公认的进行真菌菌种鉴定最可靠的方法之一。此外，皮肤癣菌的鉴定还有基于完整细胞指纹图谱技术的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)[20-21]，该技术在皮肤癣菌的鉴定中显示出较好的效果。

表3 7种抗菌药物对85株皮肤癣菌临床分离株的最低抑菌浓度(MICs)(μg·mL-1)

注：1. GM：几何均数；2. MIC50: 抑制50%试验菌株生长所需的MIC值；3. MIC90: 抑制90%试验菌株生长所需的MIC值.

本研究中7种测试药物对6种皮肤癣菌表现出不同的抗真菌特点。其中，特比萘芬对6种皮肤癣菌受试菌株的体外抗真菌活性最强，氟康唑对6种皮肤癣菌受试菌株的体外抗真菌活性最弱，国内吴等[22]和卜等[23]以及国外多数研究结果[24,25]均显示特比萘芬具有最强的体外抗真菌活性。而国外已有关于皮肤癣菌对特比萘芬耐药的报道[26-29]，因此临床和科研人员需重视特比萘芬的药物敏感性监测。此外，伏立康唑在唑类药物中对皮肤癣菌的体外抗真菌活性最强。国内邓等[30]对红色毛癣菌进行的体外药敏测定表明新一代三唑类药物相较于第一代唑类药物表现出更好的抗真菌活性，但国内尚缺乏伏立康唑对除红色毛癣菌以外的皮肤癣菌的体外药物敏感性的相关研究。伏立康唑是新一代三唑类抗真菌药物，是在氟康唑的基础上进行了分子改造。目前伏立康唑被批准用于严重侵袭性曲霉病、对氟康唑耐药的念珠菌引起的严重侵袭性感染以及足放线菌属和镰刀菌属引起的严重感染，而适应症尚未包括皮肤癣菌感染。在临床应用方面，已有报道伏立康唑成功治疗了1例红色毛癣菌引起的顽固性面部Majocchi肉芽肿[31]。伊曲康唑、酮康唑、环吡酮胺的体外抗真菌活性同国内吴等[22]和国外相关报道[25]结果相似。

综上，红色毛癣菌是我院就诊患者皮肤癣菌感染的主要致病菌。分子生物学技术应用于皮肤癣菌的菌种鉴定，具有快速、精准、可鉴定到种等优点，对于皮肤癣菌的临床诊断、防治及流行病学检测具有重要价值。皮肤癣菌感染的用药选择和皮肤癣菌感染的部位、程度以及菌种类型有关，体外药物敏感性试验在预测药物抗真菌活性方面具有重要作用，而目前我院所在的深圳地区对皮肤癣菌的药物敏感性测定尚未广泛开展。特比萘芬对本地区6种皮肤癣菌具有良好的体外抗真菌活性，在唑类药物中伏立康唑体外MIC值较低。本研究结果可为临床合理用药提供参考，但仍需进行多中心大样本量的药物敏感性试验以及体内药动学和药代学相关研究，从而更好地评价抗真菌药在患者体内的疗效。