无菌部位的念珠菌属的分布特点及耐药性分析

肖典冰

(泗泾医院 上海 201601）

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床菌株 收集2018年1月—2018年10月期间，从本院患者临床无菌部位标本中分离的65株念珠菌。

1.1.2 质控菌株 ATCC 90028白色念珠菌、ATCC22019近平滑假丝酵母菌为质控菌珠。

1.2 方法

1.2.1 常规鉴定 标本按常规方法培养、分离，沙保罗平板上纯培养、经革兰氏染色镜检，转种假丝酵母菌显色培养基进行鉴定，显绿色，翠绿色的是白色念珠菌;蓝灰色，铁蓝色的是热带念珠菌；粉红色，模糊有菌毛菌落较大的是克柔念珠菌；紫色的是光滑念珠菌。

1.2.2 仪器鉴定 显色培养基上为白色菌落或显色不清楚的念珠菌，取纯培养物用法国生物梅里埃YST鉴定卡在VITEKII全自动微生物分析仪上进行鉴定。质控菌株：白假丝酵母菌ATCC90028、近平滑假丝酵母菌ATCC22019。

1.2.3 特异性PCR检测 所有收集的菌株都用PCR扩增的方法进行最终鉴定。

1.2.3.1 念珠菌基因组DNA提取 玻璃珠振荡法提取念珠菌属DNA；（1）准备高压过的1.5ml EP管；（2）每支EP管内分装约50μl的玻璃珠；（3）向分装好玻璃珠的EP管内加入300μl～500μl双蒸水；（4）编号，使用1μl一次性接种环，从三区挑取分纯的大菌落3～4个或小菌落7～8个，在EP管中充分研磨，最终浊度控制在1.0～2.0McF之间，切勿过稀或过浓；（5）将盖好盖的EP管在振荡器上振荡30s(隐球菌60s)；（6）EP管100℃水浴/金属浴15min；（7）将水浴后的EP管置于-80℃ 1～2min，待蒸汽沉降后13,200转离心5min；（8）取新EP管编号；（9）从离心后的EP管中小心吸取上清液200～250μl左右移入新EP管中，弃去旧管；（10）将提取的DNA置于4℃进行保存。

1.2.3.2 PCR扩增体系Mix 12.5μL,ITS-1(F)0.1μL,ITS-4(R)0.1μL,DNA2μL,ddH2O,9.3μL。

1.2.3.3 PCR反应条件及电泳检测 将Eppendorf管放入PCR仪，盖好管盖，设定PCR条件。扩增条件为：94℃10min,,94℃30sec,50℃30sec,72℃60sec,72℃10min，30个循环。

1.2.3.4 DNA片段测序及序列对比： 所得序列使用Blastn与CBS真菌多样性研究中心医学真菌数据库中的标准序列(http://www.cbs.knaw.nl/databases)进行比对，并结合菌株形态学特征，即可准确鉴定至属的水平。

1.2.4 真菌药敏 真菌药敏测定按试剂说明书操作，主要步骤有制备菌悬液、接种标本并加样、矿物油封盖、35℃培养24～48h，观察结果。注意设立阴性对照孔和阳性对照孔。

2.结果

2.1 65株念珠菌的分类

显色方法结合仪器鉴定的结果显示在临床无菌部位标本中分离65株无菌部位念珠菌中，白色念珠菌28株（43.1%）,光滑念珠菌15株（23.1%）,隐球菌10株（15.4%），近平滑念珠菌5株（7.7%），无名假丝酵母菌3（4.6%），葡萄牙假丝酵母菌2（3.1%），热带念珠菌1株（1.5%），克柔念珠菌1株（1.5%），见表1。

表1 65株念珠菌的分类

PCR鉴定的结果显示在临床无菌部位标本中分离65株无菌部位念珠菌中白色念珠菌27株（41.5%）,光滑念珠菌10株（15.4%）,隐球菌10（15.4%），近平滑念珠菌7（10.8%），热带念珠菌5株（3.0%），无名假丝酵母菌3（4.6%），葡萄牙假丝酵母菌2（3.1%），克柔念珠菌1株（1.5%）,见表2。

表2 65株念珠菌的分类

2.4 药敏试验结果

ATB FUNGUS 3真菌药敏测定试剂盒（微量稀释法）法结果显示在65株念珠菌中，两性霉素B、伏立康唑、5-氟胞嘧啶和氟康唑等四种药物对白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、隐球菌、近平滑念珠菌、无名假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌、表现出较强的敏感性。两性霉素B、伏立康唑、5-氟胞嘧啶对克柔念珠菌表现出较强的敏感性。氟康唑对光滑念珠菌的敏感性较差，敏感率为84.5%。克柔念珠菌对氟康唑表现出很高的耐药性，耐药率为65.5%。伊曲康唑对念珠菌属的敏感性较差。见表3、4。

表3 65株念珠菌的药敏结果（%）

表4 65株念珠菌的药敏结果（%）

3.讨论

引起深部真菌感染的主要有念珠菌、隐球菌、曲霉、毛霉等，其中以念珠菌感染比较常见，主要包括白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌等等。其中以白色念珠菌为最常见的致病菌。当机体发生正常菌群失调或抵抗力下降时，可引起皮肤念珠菌病、粘膜念珠菌病、内脏及中枢神经念珠菌病[1]。在本组资料中，显色方法结合仪器鉴定的结果显示在临床无菌部位标本中分离65株无菌部位念珠菌中，白色念珠菌28株（43.1%）,光滑念珠菌15株（23.1%）,近平滑念珠菌5（7.7%），无名假丝酵母菌3（4.6%），葡萄牙假丝酵母菌2（3.1%），热带念珠菌1株（1.5%），克柔念珠菌1株（1.5%），PCR鉴定的结果显示在临床无菌部位标本中分离65株无菌部位念珠菌中白色念珠菌27株（41.5%）,光滑念珠菌10株（15.4%）,隐球菌10株（15.4%），近平滑念珠菌6（9.2%），热带念珠菌5株（3.0%），无名假丝酵母菌3（4.6%），葡萄牙假丝酵母菌2（3.1%），克柔念珠菌1株。可见无菌部位的念珠菌感染仍然以白色念珠菌为主，但是白色念珠菌感染所占的比例明显低于之前68.6% 的报道。

PCR方法结果发现有6株菌株与念珠菌显色培养基结合仪器鉴定的结果两者不符，1株菌株显色结果是白色念珠菌，PCR鉴定结果是热带念珠菌。3株菌株显色结果是光滑念珠菌，PCR鉴定结果是热带念珠菌。2株菌株显色结果是光滑念珠菌，PCR鉴定结果是近平滑念珠菌。这是因为显色方法对于颜色判断具有主观因素，特别是颜色本身就不明显时，判断容易出现错误。但是PCR是通过特异性的扩增ITS片段并对扩增产物进行检测，特异性与准确性较高，最终还是以PCR结果可靠。

伏立康唑被证实对念珠菌属具有良好的活性,其MIC值<0.1125mg/L有试验发现伏立康唑抗白念珠菌和热带念珠菌的活性比氟康唑高8倍[2]。因此，本此实验在利用ATB FUNGUS 3真菌药敏测定试剂盒（微量稀释法）对5-氟胞嘧啶(5-FC)、两性霉素B(AMB)、氟康唑（FCA)、伊曲康唑（ITR)、伏立康唑(VRC)进行药敏分析。本文ATB FUNGUS 3结果显示两性霉素B、伏立康唑、5-氟胞嘧啶和氟康唑等四种药物对白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、隐球菌、近平滑念珠菌、无名假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌、表现出较强的敏感性。两性霉素B、伏立康唑、5-氟胞嘧啶对克柔念珠菌表现出较强的敏感性。氟康唑对光滑念珠菌的敏感性较差，敏感率为84.5%。克柔念珠菌对氟康唑表现出很高的耐药性，耐药率为65.5%。伊曲康唑对念珠菌属的敏感性较差。两性霉素B单独使用抗真菌活性很强，对深部真菌引起的严重的内脏或全身感染的治疗效果很明显。5-氟胞嘧啶抗真菌活性谱较窄,单独使用容易产生耐药,据报道5-氟胞嘧啶与两性霉素B联合使用, 不易产生耐药性,已取得了一定疗效。因此在临床工作中针对真菌感染及时进行真菌培养和药敏试验，合理使用抗真菌药物，以提高治愈率，降低病死率。