表没食子儿茶素没食子酸酯对冷冻罗非鱼鱼糜抗冻作用机制

袁 悦，赵永强，杨贤庆,*，李来好，吴燕燕，魏 涯，岑剑伟

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室，广东 广州 510300；2.上海海洋大学食品学院，上海 201306；3.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005）

鱼糜制品是以鱼类为原料，经过采肉、漂洗、擂溃、凝胶化等工序加工制成，是我国鱼类精深加工的一个重要发展方方。鱼糜制品味道鲜美、蛋白质含量丰富、食用方便，且易工业化生产，越来越受到消费者喜爱[1-2]。作为鱼糜制品生产的重要原料，冷冻鱼糜在冻藏过程中易发生冷冻变性，且其内源性蛋白酶有可能导致蛋白质自溶[3]，因此，有必要寻找方法或技术延缓蛋白质的变性。另外，鱼糜制品在冷冻贮藏过程中，脂质在发生氧化变性时产生的自由基攻击鱼糜中的蛋白质后生成α-氨基己二酸、γ-谷氨酸半醛及其他活性羰基衍生物等有害物质，会导致蛋白质氧化变性[4]。氧化后的蛋白质更易发生交联、聚集，进而影响鱼糜的质地特征、感官品质及营养价值[5]。因此，抑制鱼糜冷冻贮藏过程中蛋白质氧化引起的肌原纤维蛋白降解对维持鱼糜品质及营养价值具有重要意义。

多酚类物质在自然界中含量丰富，且拥有较强的自由基清除及金属离子结合能力[6]，目前已有研究表明多酚类物质能够有效抑制肉制品中蛋白质的氧化。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是绿茶中最有效的抗氧化多酚类物质，在清除体内自由基、抗衰老、抗炎、抗癌、抗突变及改善肝功能等方面具有较好的功效[7]。根据GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》，为方便食品的生产、加工、包装、运输或者贮藏，厂家可以使用食品添加剂，在肉灌肠类食品中可以添加茶多酚作为抗氧化剂，且用量不得超过0.3 g/kg。为防止鱼糜在冻藏过程中因蛋白质的氧化变性而引起的鱼糜品质劣化，本实验以罗非鱼（Oreochromis niloticus）冷冻鱼糜为研究对象，探讨EGCG对冷冻鱼糜的抗冻效果，旨在为EGCG在冷冻鱼糜中充当抗冻保护剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活罗非鱼购于附近超市，体质量（500±50）g。

EGCG（纯度≥95%） 酷尔化学科技（北京）有限公司；蛋白定量试剂盒、蛋白质羰基含量测试盒 南京建成生物工程有限公司；BeyoColorTM彩色预染蛋白 上海碧云天生物技术有限公司；其他常见试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

T50型均质机 德国IKA公司；HWS 24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；3K30型台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；UV2550型紫外-可见分光光度计 日本Shimadzu公司；CT3质构仪 美国Brookfield公司；基础电泳仪 美国Bio-Rad公司；Image Scanner III扫描仪 美国GE公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼糜制作

将超市购得的鲜活罗非鱼击晕，取背部肌肉，然后去皮得到鱼片。用自来水冲尽鱼片表面污渍，并用小刀切成块状，于豆浆机中初步绞碎，将碎肉与蒸馏水按照1∶4的比例漂洗2 次，之后按同样的比例用0.25%的食盐水漂洗1 次，整个漂洗过程尽量保持在10 ℃以下。碎肉漂洗后经脱水于斩拌机中擂溃，随后每份取1 kg鱼糜，分别加入0.002 5%、0.01%、0.02%、0.03%的EGCG混合均匀（用5 mL水溶解EGCG，随后引入鱼糜中，用搅拌机混匀），最后分装于-18 ℃冰箱中冻藏。

1.3.2 肌原纤维蛋白的提取

参考Manuel等[8]的方法并略作改动。定期取0.50 g冷冻鱼糜样品，加入2.5 mL冰浴冷却的Tris-HCl缓冲液（10.00 mmol/L Tris-HCl，pH 7.2，5.00 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF）），在冰水浴的条件下以12 000 r/min均质，为避免机器过热，每均质15 s停10 s，总时间为2 min。均质后得到匀浆，于4 ℃、12 000 r/min离心15 min。弃上清液，并于沉淀中加入10 倍体积的盐溶液（0.60 mol/L NaCl，10.00 mmol/L Tris-HCl缓冲液，5.00 mmol/L PMSF，pH 7.2）后均质混匀。将溶液放在冰水浴里面静置25～30 min后，于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，所得上清液即为肌原纤维蛋白溶液，并置于-80 ℃冰箱中备用。

1.3.3 肌原纤维蛋白含量的测定

采用Bradford蛋白检测试剂盒方法测定。

1.3.4 肌原纤维蛋白巯基含量的测定

参考Kittiphattanabawon等[9]的方法并略作修改。取0.50 mL提取的蛋白质溶液（必要时加以稀释），空白对照组则取0.60 mol/L的NaCl溶液，随后加入4.50 mL的Tris-HCl缓冲液（0.20 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，8.00 mol/L尿素，20.00 g/L SDS，10.00 mmol/L EDTA），旋涡混匀1 min。接着取3.00 mL上述溶液，加入0.30 mL 5,5’-二硫代双(2-硝基)苯甲酸（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）溶液（1.00 g/L DTNB，0.20 mol/L Tris-HCl，pH 8.0），最后利用恒温水浴锅水浴加热，温度40 ℃，时间25 min。双蒸水调零，测定各组溶液在波长412 nm处的吸光度，巯基含量计算如式（1）所示[10-11]：

式中：A为412 nm波长处的吸光度；n为稀释倍数；ε为摩尔吸光系数13 600 L/（mol•cm）；ρ为蛋白质质量浓度/（mg/mL）。

1.3.5 肌原纤维蛋白羰基含量的测定

采用蛋白质羰基含量测试盒测定方法。

1.3.6 SDS-PAGE分析

将提取的肌原纤维蛋白溶液用相应的蛋白提取液稀释到1.00 mg/mL左右，参考李娜等[12]的方法进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。将稀释后的肌原纤维蛋白溶液与2×SDS-PAGE上样缓冲液等体积混合，100 ℃水浴5 min，12 000 r/min离心5 min后，回集上清液作为电泳待上样品。本实验选择的分离胶12%，浓缩胶5%，上样量为15.0 μL。电泳开始时，先以80 V恒压使样品在浓缩胶部分浓缩成一条线，之后将电压切换到150 V，直到溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色，之后脱色至背景无色，最后扫描并分析条带。

1.3.7 鱼糜凝胶强度的测定

将冷冻的罗非鱼鱼糜样品解冻，然后绞碎，加入2.5%食盐并擂溃3 min，灌入肠衣。采用二段式加热（40 ℃加热30 min，90 ℃加热15 min）使其凝胶化[13]，冷却至室温后于4 ℃冰箱过夜。将样品切成25 mm高的圆柱体，用质构仪测定凝胶强度。探头直径5 mm、下压位移15 mm、触发值5 g、测试速率1.0 mm/s。凝胶强度计算如式（2）所示：

1.3.8 鱼糜凝胶持水性的测定

将1.3.7节制得的鱼糜凝胶样品切成3 mm的薄片，称其质量记为m1，然后薄片上下均放3 层滤纸，最后放置5 kg的重物，10 min后称其质量记为m2。压出水分代表持水性，其计算如式（3）所示：

1.4 统计分析

采用Excel 2007作图，SPASS 22.0进行方差分析。各组计算数据均以表示，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 EGCG添加量对罗非鱼鱼糜肌原纤维盐溶性蛋白含量的影响

图1 罗非鱼鱼糜肌原纤维盐溶性蛋白含量的变化Fig. 1 Changes in salt solubility of myofibrillar protein from Nile tilapia surimi during frozen storage

鱼糜中的蛋白质包含盐溶性蛋白、水溶性蛋白以及不溶性蛋白，鱼糜凝胶形成机理主要是肌原纤维蛋白通过氢键、二硫键、离子键等化学作用力形成三维空间网络结构的过程[1]，且鱼糜凝胶强度与盐溶性蛋白含量呈极显著正相关[14]，因此盐溶性蛋白含量的高低是鱼糜品质的重要影响因素。如图1所示，随着冻藏时间的延长，5 组罗非鱼鱼糜肌原纤维盐溶性蛋白呈显著下降趋势（P＜0.05）。其中，空白组、EGCG添加组鱼糜肌原纤维盐溶性蛋白含量分别从冻藏第1周的（18.80±0.56）、（19.95±1.20）、（20.33±0.49）、（20.27±0.55）、（19.57±0.06）mg/g下降至第10周的（5.98±0.44）、（7.02±0.13）、（9.25±0.27）、（7.08±0.38）、（6.37±0.45）mg/g，下降率分别为68.2%、64.8%、54.5%、65.1%与67.5%。由此可知，EGCG添加组肌原纤维盐溶性蛋白下降率减少，且当EGCG添加量为0.01%时，肌原纤维盐溶性蛋白下降的幅度最少。汪金林[15]在研究茶多酚对冷藏养殖大黄鱼品质影响时，发现茶多酚处理组的鱼肉肌原纤维盐溶性蛋白下降速度减慢，且随着茶多酚浓度的增加，下降速率越小。

2.2 EGCG添加量对罗非鱼鱼糜肌原纤维蛋白巯基含量的影响

巯基是肌原纤维蛋白中最具反应活性的功能基团，鱼糜在冻藏期间，巯基易被氧化成二硫键导致含量下降。此外，蛋白质发生冷冻变性引起空间结构发生改变，隐藏在蛋白质分子内部的巯基暴露，进而被氧化成二硫键，导致总巯基含量进一步下降[16]。二硫键的形成会影响蛋白质的一些功能特性如持水、乳化能力和可溶性等，因而巯基含量的变化可以反映出蛋白质变性的程度[17]。如图2所示，在前2 周的冻藏期间，鱼糜肌原纤维蛋白总巯基含量增加，可能是由于肌原纤维蛋白发生冷冻变性，空间结构易位，蛋白质分子内部的巯基暴露出来，同时冻藏初期的巯基氧化较少，导致总巯基含量有一个小幅度上升；2 周后，各组罗非鱼鱼糜肌原纤维蛋白总巯基含量显著下降（P＜0.05）；冻藏至第10周，空白组和添加0.002 5%、0.01%、0.02%、0.03% EGCG的鱼糜组肌原纤维蛋白总巯基含量分别从冻藏前的8.11×10-5、8.65×10-5、9.25×10-5、9.22×10-5mol/g和8.39×10-5mol/g降低到3.01×10-5、3.76×10-5、4.7×10-5、3.27×10-5mol/g和3.09×10-5mol/g，分别降低了62.9%、56.5%、49.2%、64.5%和63.2%，且0.01% EGCG鱼糜组总巯基含量显著高于其他组（P＜0.05）。由此可知，添加EGCG一定程度上能够抑制肌原纤维蛋白巯基含量的下降，但当EGCG添加量过高时，反而会导致肌原纤维蛋白巯基含量下降，可能的原因是部分EGCG氧化成相应的醌类物质，而醌类物质既可能催化巯基方二硫键转变，又可能直接与巯基共价结合，这都会导致巯基含量的降低。Amjad等[18]研究发现，氧化多酚（阿魏酸、单宁酸、儿茶素和咖啡酸）添加会引起鱼糜蛋白巯基含量降低，二硫键含量升高；Cao Yungang等[19]研究发现，高浓度绿原酸添加会导致肌原纤维蛋白巯基含量降低。

2.3 EGCG添加量对罗非鱼鱼糜肌原纤维蛋白羰基含量的影响

图3 罗非鱼鱼糜中肌原纤维蛋白羰基含量的变化Fig. 3 Changes in carbonyl content of myofibrillar protein from Nile tilapia surimi during frozen storage

蛋白质羰基化是一种不可逆的、非酶促引起的蛋白质修饰，鱼糜在冻藏时容易发生氧化羰基化，破环蛋白质的完整结构，增强蛋白质之间的交联，进而影响鱼糜的品质，因此羰基含量常用作鱼糜蛋白质氧化变性的一个重要指标[20]。由图3可知，随着鱼糜冻藏时间的延长，各处理组羰基含量呈上升趋势，说明鱼糜肌原纤维蛋白发生了不同程度的氧化。冻藏前4 周，各组鱼糜肌原纤维蛋白羰基含量上升趋势较缓慢，且空白组羰基含量显著高于EGCG添加组（P＜0.05）；4 周以后，各组鱼糜中蛋白质羰基含量上升速度加快，到了冻藏末期，空白组羰基含量达到了（6.32±0.78）nmol/mg，各EGCG添加组分别为（4.86±0.09）、（3.69±0.11）、（3.76±0.16）、（3.66±0.45）nmol/mg，蛋白质羰基含量上升幅度均显著低于空白组（P＜0.05），且EGCG添加量为0.01%、0.02%、0.03%时没有明显差异（P＞0.05）。此结果与Manuel等[8]在研究茶多酚对马鲛鱼（Scomberomorus niphonius）鱼糜肌原纤维蛋白羰基化的抑制效果相类似。

2.4 SDS-PAGE分析

肌球蛋白和肌动蛋白约占肌原纤维蛋白的70%[21]。由图4能够清晰看到肌球蛋白重链、肌动蛋白、原肌球蛋白和5 个未知条带。图中没有出现肌球蛋白轻链，可能的原因是长时间的冻藏导致轻链降解。此外，EGCG添加组的肌球蛋白重链、肌动蛋白以及未知名蛋白质（I、II）条带颜色较空白组深，而原肌球蛋白和未知名蛋白质（III、IV、V）条带与空白组基本相同，说明EGCG对肌球蛋白重链、肌动蛋白以及未知名蛋白质（I、II）具有一定的保护作用，而对原肌球蛋白和未知名蛋白质（III、IV、V）的降解没有明显抑制作用，最后，添加了0.01% EGCG的组蛋白条带颜色最深。结果表明，冷冻罗非鱼鱼糜在冻藏过程中，肌原纤维蛋白容易受到冷冻变性、氧化变性、自身蛋白酶及微生物蛋白酶共同作用而降解。另外，空白组降解速率明显快于EGCG添加组，故EGCG在一定程度上能够延缓肌原纤维蛋白的降解和变性，且添加质量分数为0.01%的EGCG效果最佳。Sun Lijun等[22]研究了青苹果多酚对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）鱼糜的影响，发现添加青苹果多酚的组肌原纤维蛋白条带密度明显比空白组高，且此研究还能略微看到肌球蛋白轻链条带。

图4 冻藏末期肌原纤维蛋白SDS-PAGE图Fig. 4 SDS-PAGE profiles of myofibrillar protein at the end of frozen storage

2.5 EGCG添加量对罗非鱼鱼糜凝胶强度的影响

图5 -18 ℃冻藏过程中罗非鱼鱼糜凝胶强度的变化Fig. 5 Changes in gel properties of Nile tilapia surimi during frozen storage at -18 ℃

凝胶强度发生变化，可以一定程度说明肌原纤维蛋白发生了变化，同时鱼糜的品质也在发生变化。如图5所示，随着冻藏时间的延长，各组鱼糜凝胶强度呈显著下降趋势（P＜0.05），其中空白组基本呈显著直线下降（R=0.997），而EGCG添加组的凝胶强度在前面4 周下降趋势较为缓慢，之后速度变快。冻藏末期，空白组鱼糜凝胶强度由4 330.91 g·mm下降到909.23 g·mm，下降幅度达79.0%，其中EGCG添加量为0.01%时，凝胶强度显著高于其他各组（P＜0.05），由起初的4 285.81 g·mm下降到1 739.20 g·mm，下降率为59.4%，为抗冻效果最好的一组。EGCG属于多酚类物质，含有大量的羟基，可能与蛋白质形成牢笼式结构的络合物从而束缚大量水分子，同时减少了水溶性蛋白对鱼糜凝胶的影响，使得凝胶结构更为致密，凝胶强度变高[3]。此外，冻藏末期，EGCG添加量为0.02%和0.03%时，鱼糜凝胶强度显著低于其他EGCG组（P＜0.05），表明高质量分数EGCG对鱼糜的抗冻效果要比低质量分数EGCG差。Jongberg等[23]发现高浓度绿茶提取物破坏乳化肉体系的凝胶性能，但低浓度并无显著影响；曹云刚[24]研究发现，在轻度氧化条件下，添加少量没食子酸能提高肌原纤维蛋白的凝胶性能，过量则会明显破坏其凝胶性能。

2.6 EGCG添加量对罗非鱼鱼糜持水性的影响

图6 -18 ℃冻藏过程中罗非鱼鱼糜凝胶持水性的变化Fig. 6 Changes in water-holding capacity of Nile tilapia surimi during frozen storage at -18 ℃

持水性是指鱼糜凝胶在强烈挤压下维持水分的能力[25]，压出的水分越少，样品的持水性越好[26]。反之，凝胶网络结构越不致密，凝胶特性越差。因此持水性的大小也是决定鱼糜凝胶品质的重要因素之一。如图6所示，空白组和EGCG添加组鱼糜凝胶压出水分显著上升（P＜0.05），表明持水性降低。前4 周，空白组鱼糜持水性逐渐降低，各EGCG添加组鱼糜持水性降低速度较空白组慢；4 周之后，各组鱼糜持水性下降速度加快，其中添加0.002 5%和0.01% EGCG的鱼糜组持水性相对于其他组而言，凝胶持水性下降趋势比较缓慢；冻藏末期，添加0.02%和0.03% EGCG的鱼糜组压出水分显著高于空白组（P＜0.05），表明EGCG添加量过大反而促使罗非鱼鱼糜凝胶持水性降低，可能是由于EGCG浓度过大，与蛋白质间相互作用形成的混合体系与其他成分交叉连接变多，导致大颗粒的形成和难溶物质的凝集，这种聚集现象导致蛋白质分子间接触频率减少，使得蛋白质网络结构断裂[27-28]，锁水能力下降，凝胶的持水性下降，此结果说明低添加量EGCG对罗非鱼鱼糜具有一定的保水效果，反之则有害，这与凝胶强度的测定结果相似。米红波等[29]研究发现，添加6-姜酚后草鱼鱼糜凝胶强度和持水性明显高于空白组，且添加量为1%时效果最好。

3 讨 论

作为优质天然高效抗氧化剂，植物多酚或者富含多酚的植物提取物逐渐被应用于肉制品中以替代可能对人体健康具有潜在危害的合成抗氧化剂[30-31]。多酚类物质的抗氧化机理在于[32-34]：1）酚羟基可作为氢供体，具有良好的自由基清除能力，能有效减慢或终止自由基链式反应；2）多酚类物质具有金属离子螯合能力；3）酚类化合物可以通过非共价相互作用与某些促氧化酶结合，抑制酶的活性，达到抗氧化效果。

在冻藏过程中，鱼糜蛋白易发生冷冻变性和蛋白质氧化变性[35]。结果显示，肌原纤维蛋白巯基含量在冻藏期间先小幅度上升，随后逐渐下降，可能原因是蛋白质空间构象发生改变，分子内部巯基暴露，肌原纤维蛋白降解[36-37]。EGCG影响了冷冻罗非鱼鱼糜肌原纤维蛋白巯基含量，很可能是因为EGCG含有的8 个羟基通过共价键或非共价键的作用与蛋白质疏水基团结合，延缓疏水基团的释放，从而抑制肌原纤维蛋白降解[38]。此外，在冻藏过程中鱼糜蛋白发生氧化羰基化作用，导致肌原纤维蛋白羰基含量上升，破坏了蛋白质的完整性，添加EGCG后，羰基含量明显减少，这可能要归因于EGCG的自由基清除能力及金属离子螯合能力[39]，咖啡酸能有效阻止鱼糜在加工及冻藏时蛋白质的氧化[40]；Shi Ce等[41]发现葡萄籽及丁香苞提取物能减缓冻藏时鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）蛋白质的氧化。

冷冻鱼糜中肌原纤维蛋白含量最为丰富，将其斩拌后添加配料，灌入肠衣，经过加热后得到弹性凝胶体。有不少研究[42-44]表明，冷冻鱼糜在冻藏时盐溶性蛋白含量和Ca2+-ATPase活性随冻藏时间延长而降低、液滴损失随冻藏时间延长而增加，这些指标变化通常与鱼糜持水性相关联。从本实验可以看出，随着冻藏时间的延长，各组鱼糜盐溶性蛋白含量、凝胶强度、持水性均逐渐下降，可能的原因是蛋白质发生冷冻变性及氧化降解。此外，与空白组相比，EGCG能有效抑制肌球蛋白重链、肌动蛋白以及未知名蛋白质（I、II）的降解，肌球蛋白重链降解程度与水产品蛋白质冷冻变性程度呈正相关[45]，且当EGCG添加量为0.01%时，效果最佳。

综上，EGCG在冷冻罗非鱼鱼糜的冻藏过程中能有效防止蛋白质变性，提高鱼糜的品质，有望作为一种新型抗冻剂。但EGCG添加量不宜过大，否则会起相反作用，鱼糜中EGCG添加量为0.01%时，肌原纤维盐溶性蛋白含量下降最少；总巯基含量降低最少；凝胶强度下降最低；持水性下降最低，鱼糜还能保持较好品质。今后的研究还需要考察EGCG添加量过大反而会引起鱼糜品质劣化的原因，及应用其他新技术分析EGCG对鱼糜的抗冻作用机理。