基于气相离子迁移谱检测静电场处理的大菱鲆品质

陈东杰，张明岗，聂小宝，姜沛宏，张玉华,*，张长峰，任 芳

（1.山东省农产品贮运保鲜技术重点实验室，山东 济南 250103；2.国家农产品现代物流工程技术研究中心，山东 济南 250103；3.潍坊工程职业学院，山东 青州 262500；4.山东海能科学仪器有限公司，山东 德州 251500）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）因肌肉白嫩、高蛋白、低脂肪、口感爽滑鲜嫩、风味独特等特点，深受广大消费者喜爱。因其肌肉柔软，含水量高，体内组织酶类活性强，在贮藏过程中极易滋生微生物，致使鱼肉腐败变质，造成重大经济损失[1-2]，研究其保鲜技术具有重大意义。目前鱼肉保鲜方法有气调贮藏、冷冻和保鲜剂涂膜[3-5]等。气调贮藏及射线对场地和设备要求较高；冷冻贮藏解冻后影响大菱鲆风味及口感；保鲜剂涂膜操作繁琐、不易操作且不利于商业化。静电场贮藏保鲜技术是一种新型的食品保鲜技术，可影响生物体某些生物酶的活力，一定频率和强度的静电场可抑制微生物生长与繁殖。目前静电场技术已应用在番茄、草莓、鸡蛋、罗非鱼[6-9]贮藏中，但目前尚无静电场对大菱鲆贮藏效果的研究。

气相色谱离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一种将离子迁移谱技术和气相色谱技术两者结合的检测技术[10]，此检测技术克服离子迁移谱技术分离度差的局限性，使得离子迁移谱信号响应经气相预分离后质量上得到显著改善，而离子迁移谱通过漂移时间信息又使得气相色谱分离后得到的化学信息更加丰富；GC-IMS技术充分发挥了不同仪器各自的优点，产生长处相互叠加的优势[11-12]。该技术具有快速、灵敏、无需前处理、简单的优点，已应用于食品风味分析、品质检测等多个领域[13-16]。

本实验探讨4 ℃贮藏静电场处理对大菱鲆贮藏品质指标如总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、假单胞菌及菌落总数等影响。利用GC-IMS技术测定静电场处理大菱鲆的挥发性物质组成成分及其相对含量的变化，为大菱鲆风味物质的分离鉴定、指纹图谱的构建及风味物质的理论研究提供参考。通过电子鼻对不同贮藏时间内大菱鲆进行连续的气味指纹信息采集，采用不同化学计量学方法进行快速统计分析，为大菱鲆贮藏期品质检测提供简便、实用、快捷、准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大菱鲆购自于山东海鲜大市场，挑选体型较大，同一年龄、新鲜、健康、活跃的大菱鲆，保活运至实验室，暂养24 h后停食，宰杀。去除头、尾、内脏及鱼鳞，用蒸馏水冲洗后分割为大小相近、厚薄均匀的鱼肉（50±5.0）g，用保鲜膜包装，置于冷库（4±0.5）℃贮藏。

1.2 仪器与设备

F6/10-104-S组织破碎机 上海弗鲁克流体机械制造有限公司；EL204-IC电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；BL-75A高温灭菌锅 上海博迅实业有限公司；RX-2智能型人工气候培养箱 宁波江南仪器厂；MS3 digital涡旋混匀器 德国艾卡设备有限公司；PL-CJ-2N超级洁净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；Scientz-04无菌均质器 宁波新芝生物科技股份有限公司；LRH-70培养箱 上海蓝豹实验仪器有限公司；K110F凯氏定氮仪 济南海能仪器有限公司；FOX4000电子鼻 法国Alpha MOS公司。FlavourSpec 1H1-00053型GC-IMS 德国G.A.S.公司；CTC-PAL自动进样装置 瑞士CTC Analytics AG公司；CLOT毛细管柱（30 mm×0.25 mm，0.50 μm） 德国CS Chromatographie Service GmbH公司；77-1型磁力搅拌器 天津赛得利斯仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 静电场处理

图1 大菱鲆静电场处理示意图Fig. 1 Schematic illustration of the electrostatic field for treating S. maximus

处理大菱鲆的静电场装置为实验室自制，如图1所示。本实验采用交流电场（～220 V），经图1中的控制器加到高压电源上，通过高压电缆，产生4.0～5.0 kV/m的静电场；同时可产生较多的臭氧和负离子，将分割完成包装大菱鲆置于负极平板上，与接地正极板间距为50 cm，对照组置于不通电极板，不用任何静电场处理。分别于第0、4、6、8、10、12、14天取样品，测定TVB-N值、菌落总数、假单胞菌数、TBA值，利用电子鼻进行气味指纹分析，并采用GC-IMS对大菱鲆贮藏期间挥发性风味物质进行测定分析。

1.3.2 TVB-N值测定

按照GB/T 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》[17]方法测定。

1.3.3 菌落总数测定

按照GB/T 4789.2—2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》[18]方法进行。

1.3.4 假单胞菌测定

采用CFC假单胞菌琼脂培养基，在28 ℃培养箱培养48 h，计数。

1.3.5 TBA值的测定

参照李婷婷等[5]方法。称取10.0 g搅碎鱼肉于烧杯中，加入25 mL蒸馏水和25 mL 10%的三氯乙酸溶液，均质，静置30 min过滤。取5 mL上清液于比色管中，然后方比色皿中加入5 mL的TBA溶液（0.02 mol/L）。将上述混合液在（80±1）℃的恒温水浴加热40 min，之后冷却至室温，在532 nm波长处测定吸光度。TBA值以丙二醛（malondialdehyde，MDA）质量计算，单位为mg/100 g。

1.3.6 电子鼻检测

称取2.0 g搅碎的肉样装入10 mL样品瓶，加盖密封，每个样品重复6 次。实验前先对电子鼻测定参数进行优化，根据传感器的响应信号，确定电子鼻的测定参数为：载气流速150 mL/min，顶空产生温度40 ℃，进样体积2 500 μL，进样速率2 500 μL/s，顶空产生时间600 s，数据采集时间120 s，延滞时间400 s。采用主成分分析（principlal component analysis，PCA）和线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）对样品进行分析，去除样品中差异较大的个体。

1.3.7 GC-IMS测定条件

1.3.7.1 顶空进样条件

顶空孵化温度45 ℃；孵化时间10.0 min；加热方式：振荡加热；顶空进样针温度50 ℃；进样量500.0 μL，不分流模式；载气：高纯氮气（纯度≥99.999%，推断和清洗进样针）；清洗时间0.50 min。

1.3.7.2 GC-IMS条件

色谱柱温度40 ℃；运行时间15 min；载气：高纯N2（纯度≥99.999%）；流速：初始5.0 mL/min，保持10 min后在5 min内线性增至150 mL/min。漂移管长度5 cm；管内线性电压400 V/cm；漂移管温度40 ℃；漂移气（高纯N2，纯度≥99.999%）；流速150 mL/min；IMS探测器温度45 ℃。

1.3.8 检测方法

取3.0 g样品，放入20.0 mL顶空进样瓶中，45 ℃孵化10.0 min，经顶空进样用FlavourSpec®风味分析仪进行测试，经G.A.S公司开发的强大功能软件分析可给出样品中挥发性有机物的差异谱图；软件内置的NIST数据库和IMS数据库可对物质进行定性分析。

1.4 数据分析

采用SPSS 23.0软件进行数据分析，P＜0.05，差异显著；运用PCA、LDA对数据进行处理，结果由Origin pro 2016软件进行绘图，二维可视化软件为LAV 2.0（G.A.S. Inc.）。

2 结果与分析

2.1 大菱鲆冷藏过程中品质指标变化

2.1.1 TVB-N值

图2 静电场对大菱鲆中TVB-N值的影响Fig. 2 Time-dependent effect of electrostatic field on TVB-N content in S. maximus

如图2可知，在贮藏过程中，大菱鲆的TVB-N值不断升高，贮藏前8 d，静电场处理组与对照组的TVB-N值变化均较小，两者无显著性差异（P＞0.05）。第8天后对照组和静电场处理组呈快速增长趋势，根据我国水产品鲜度的国家标准TVB-N不大于30 mg/100 g[19]为新鲜，对照组贮藏至第10天已超过30 mg/100 g，大菱鲆已呈现明显腐败特征，而静电场处理组至第12天才超过30 mg/100 g，反映出静电场处理可延缓大菱鲆新鲜度下降。

2.1.2 菌落总数

菌落总数指标是判断鱼类新鲜度重要的指标。由图3可知，整个贮藏期间，大菱鲆菌落总数整体呈现明显增长趋势。静电场处理组与对照组的增长趋势大体一致，但对照组的菌落总数在在贮藏期间始终高于静电场处理组。根据GB/T 4789.2—2010规定的方法测定，当细菌总数大于6（lg（CFU/g））时，判定肉样变质，对照组在贮藏至第10天后超过6（lg（CFU/g）），而静电场处理组在第12天后超过6（lg（CFU/g））。对照组在贮藏至第10天后开始腐败，而静电场处理组在12 d后腐败，说明静电场处理一定程度上抑制微生物生长。

图3 静电场对大菱鲆中菌落总数的影响Fig. 3 Time-dependent effect of electrostatic field on TBC in S. maximus

2.1.3 假单胞菌数

假单胞菌为大菱鲆冷藏条件下的优势腐败菌之一[20]。由图4可知，随着大菱鲆贮藏时间延长，假单胞菌呈快速增长趋势。贮藏前8 d，对照组与静电场处理组的假单胞菌增长趋势一致，无显著性差异（P＞0.05）。而贮藏8 d后，对照组假单胞菌增长速度明显高于静电场处理组，静电场处理组的假单胞菌数显著低于对照组（P＜0.05），说明静电场可以抑制假单胞菌的生长，其原因可能是假单胞菌为原始生物，体内存在与类似微管蛋白功能的物质[21]，在电场作用而导致其细胞分裂出现异常。

2.1.4 TBA值

鱼肉肌肉组织富含大量不饱和脂肪酸，而不饱和脂肪酸氧化产物MDA可以与TBA产生稳定红色物质，其红色物质在532 nm波长处有最大吸回峰。TBA可以反映出大菱鲆组织肌肉被氧化的程度，TBA值越大，表明鱼肉的脂肪氧化程度越高。如图5所示，贮藏前8 d，静电场处理组和对照的TBA值增长缓慢；贮藏8 d后，对照组和静电场处理组的TBA值呈现快速增长趋势，而静电场处理组增长速率明显低于对照组说明静电场能够降低脂质氧化程度，这与赵良等[22]研究静电场可以抑制罗非鱼的脂肪氧化的结果一致，但贮藏到第14天时静电场处理组与对照组并无显著差异（P＞0.05）。

图5 静电场对大菱鲆中TBA值的影响Fig. 5 Time-dependent effect of electrostatic field on TBA value in S. maximus

2.2 大菱鲆电子鼻传感器响应值分析

LDA是利用已知类别的样品建立判别模型，为未知类别的样本判别的一种统计方法[23]。图6为贮藏期间大菱鲆电子鼻响应值的LDA结果，LD1和LD2的贡献率分别为70.53%和24.47%，两者累计贡献率为95.00%。说明这两个主成分基本上可以反映出大菱鲆所有的特征信息。LDA可将不同贮藏时间下静电场处理组和对照组的大菱鲆区分开，且没有重叠区域。

图6 贮藏期间大菱鲆电子鼻响应值信号的LDAFig. 6 LDA plot of e-nose sensor signals for S. maximus during storage

图7 贮藏期间大菱鲆电子鼻响应值信号的PCAFig. 7 PCA plot of e-nose sensor signals for S. maximus during storage

PCA是将多个指标通过降维转换成少数几项具有代表性的综合指标的一种多元统计分析方法[24]。通常认为累计贡献率超过80%，表明基本包含样品的信息。PC1和PC2的贡献率分别为98.27%和1.17%，两者累计贡献率为99.44%。说明这两个主成分基本上可以反映出大菱鲆所有的特征。从图7可以看出，PCA可将不同贮藏时间下对照组和静电场处理组的大菱鲆品质区分开，且没有重叠区域。

2.3 静电场处理二维谱图分析

图8 大菱鲆的GC-IMSFig. 8 GC-IMS profiles of S. maximus

图8 为静电场处理和对照组大菱鲆挥发性物质的组分差异变化，第0天大菱鲆样品为参比，以便观察不同贮藏时间大菱鲆挥发性物质与参比样品之间的差异。反应离子峰右侧的每一个点代表一种挥发性有机物，蓝色为背景，红色代表物质成分，颜色越深表示含量越高。从图8可以看出，不同处理方法及不同贮藏时间内挥发性组分可通过GC-IMS技术很好地分离，且可直观看出不同贮藏时间段的挥发性物质差异，根据挥发性物质气相色谱保留时间和离子迁移时间对挥发性组分进行定性分析。大菱鲆贮藏过程中，共计检测出66 种挥发性物质，通过内置的NIST 2014气相保留指数数据库与G.A.S的IMS迁移时间数据库进行二维定性，确定了28 种具体挥发性物质组成（表1）。为更加方便地对比不同样品间挥发性有机物的差异，LAV软件的Gallery Plot插件可选取图中所有的待分析区域，自动生成指纹图谱。

由图9可知，将对照组处理大菱鲆指纹图谱分成A、B、C、D、E 5 个区域，区域A标出的物质在新鲜大菱鲆中含量最高，随着贮藏时间的延长，A区此类物质比如3-甲基丁醇、戊醛、苯乙醛、异丁烯等物质消失。区域B为大菱鲆贮藏6 d后出现的挥发性物质，C区域为存放10 d时出现苯甲醛、环己酮等特殊挥发性物质，区域D标出的物质在存放14 d中存在，14 d之前的样品中含量较少，例如2,3-丁二酮（饭膄味）此类物质的存在与否可判断大菱鲆的贮藏时间；区域E中标出的物质在存放10 d后开始出现，例如2-庚酮、乙酸异丙酯、异戊酸乙酯、1-戊醇等随着贮藏时间延长而增加。A区域标注的物质在存放5 d的大菱鲆中含量很少，而2,3-戊二酮、2-戊酮、2-甲基丁酸甲酯、1-辛烯-3-醇、3-甲硫基丙醛、丁酸乙酯、2-庚酮等此类物质在新鲜的大菱鲆中及存放10 d后的大菱鲆中均存在，具体原因有待进一步研究。

表1 大菱鲆挥发性组分的定性Table 1 Volatile compounds of S. maximus identi fied by GC-IMS

图9 对照组大菱鲆不同贮藏时间指纹图谱Fig. 9 Fingerprint profiles of control group at different storage times

图10 静电场处理下大菱鲆的指纹图谱Fig. 10 Fingerprints of electrostatic field-treated group at different storage times

由图10可知，将静电场处理大菱鲆指纹图谱分成A、B、C 3 个区域，区域A中标出的物质在新鲜大菱鲆中存在，贮藏6 d后区域A类挥发性有机物如1-辛烯-3-醇、苯乙醇、苯乙醛等，仅有苯乙醛尚可检测出其含量。区域B中标出的物质如正己醇、2-丁酮等仅在贮藏中5 d时生成，贮藏10 d后B区域的物质消失。C中标出的物质如环己酮、苯甲醛、丁酸乙酯等中存放10 d后含量最高，通过此类物质可判断大菱鲆大致贮藏时间。C区域挥发性物质如3-甲硫基丙醛、正戊醛、3-甲基-1-丁醇、1-戊醇、正己醛、甲基丙基甲酮、2,3-戊二酮等在静电场中存放10 d及14 d后此类物质含量极剧减少此类物质的存在及含量可用于判断大菱鲆在静电场中的存放时间，区域B中标出的物质在存放10 d的大菱鲆样品中含量最少，在存放14 d的样品中含量最高。

图11 不同处理处理下大菱鲆的指纹图谱Fig. 11 Fingerprints of S. maximus with different treatments

如图11可知，挥发性有机物如2-丁酮、正己醇、环己酮、2-甲基丁酸甲酯、乙酸异丙酯、1-戊醇、苯甲醛、甲基丙基甲酮、2,3-戊二酮等在对照组中含量最高，而在静电场中处理的样品此类物质含量很少，即不同处理方式的样品挥发性有机物的种类不同。通过对照组及静电场处理的对比可知，相同的存放时间下，静电场中大菱鲆中挥发性有机物的种类和含量明显少于对照组中，即验证了静电场了延长大菱鲆的货架期。

3 讨 论

新鲜鱼肉变质腐败主要是优势腐败菌大量活动繁殖造成[25]，采用静电场处理的鱼肉后与对照组相比，表现出更好的贮藏效果，可将菌落总数、假单胞菌数、TBA值和TVB-N值维持相对较低的水准。这与岑剑伟等[9]研究高压静电场对延长罗非鱼片的货架期和陈文波等[26]研究静电场可抑制白切鸡的微生物结果一致。静电场可能通过改变微生物体内生命大分子电荷分布，影响其体内酶的活性，进而影响酶与底物的接触反应，从而影响微生物细胞的正常代谢活动[27-28]。静电场虽可以抑制优势腐菌的生长，减缓微生物的生长速率，降低微生物对鱼肉的破坏，在一定程度上，延长了大菱鲆鱼肉的货架期，但不能彻底杀死微生物，大菱鲆贮藏后期，微生物依旧大量繁殖致使大菱鲆腐败。

目前，测定样品中挥发性物质常用的检测是采用气相色谱-质谱或者顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用测定，该方法需要破坏原始样品进行前处理，通过谱图库检索对应峰进行定性，计算峰面积进行定量，但碎片离子导致的解谱困难，不能做到快速无损检测。而GC-IMS技术结合气相色谱的分离能力和离子迁移谱快速响应、高灵敏度的优势，具有操作简单、快速无损以及重复性好等特点。而且无需样品前处理且分析的温度远低于相传统的气相色谱-质谱法，GC-IMS法测得挥发性物质更真实反映贮藏环境的样品的挥发性物质[29-31]。本研究采用GC-IMS技术对静电场处理和对照组不同贮藏时间大菱鲆的挥发性物质检测，检测结果很直观展现出采用静电场处理与对照组的大菱鲆在贮藏过程中产生挥发性物质的差异。可以看出挥发性有机物如1-辛烯-3-醇、苯乙醇、苯乙醛，只存在于贮藏前6 d，可用于判断大菱鲆在静电场中的贮藏时间。贮藏到第14天时，静电场处理的鱼肉挥发性物质明显少于对照组，原因可能是静电场抑制微生物分解为肌肉中蛋白质、氨基酸等物质。大菱鲆贮藏过程中，共计检测出66 种挥发性物质，GC-IMS检测出的66 种物质均可以提供保留指数，GC-IMS定性依据是基于GC-MS数据库，即使用气相保留指数和离子迁移时间进行二维定性。但由于目前IMS数据库在水产领域的数据库还不完善，66 种化合物中只有28 种挥发性有机物有迁移时间，故二维定性只能给出28 种物质的定性结果。定性剩余38 种挥发性物质，有待于进一步研究。

4 结 论

静电场保鲜技术可有效延长大菱鲆的货架期，可抑制大菱鲆菌落总数和优势腐败菌（假单胞菌）生长繁殖，降低TVB-N和TBA产生，使其维持在较低水平。通过GC-IMS技术可以快速检测不同方法处理大菱鲆产生的挥发性物质。利用电子鼻对大菱鲆连续的指纹信息采集，结合PCA和LDA化学计量学方法处理，可以将不同贮藏时间下静电场处理与对照组样品区分开。说明GC-IMS和电子鼻都可用于大菱鲆品质快速检测。本实验虽然研究了静电场对贮藏过程大菱鲆鱼肉新鲜度的影响，但对其产生作用机理和静电场对大菱鲆营养品质是否产生影响都未进行深入细致分析，需要后续进一步深入研究。