啤酒酿造中二甲基硫、甲基蛋氨酸、二甲基亚砜含量的变化与控制

刘 成，杜金华*，鲍 姣

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰发 271018；2.山东泰山啤酒有限公司，山东 泰发 271000）

二甲基硫（dimethyl sulfide，DMS），又名二甲基硫醚，在自然界中普遍存在，是最重要的挥发性硫化物，它是海洋温度高低自动调节的重要物质。DMS是GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》[1]中规定的允许使用的食用香料，主要用于配制玉米、番茄、土豆、奶制品、菠萝和橘子类果香及青香型香精。适度的DMS含量对啤酒风味有益，但过量会对啤酒风味产生不良影响。DMS在水中的阈值为30 μg/L，不同啤酒中的阈值会因啤酒种类不同也有所不同，大多酿酒师认为阈值为30～60 μg/L[2-3]。控制啤酒中DMS质量浓度在60 μg/L以下被国际酿酒师所接受[4-5]，过量的DMS会导致啤酒有一种“生酒味”、“菜味”、“煮玉米味”、“甜麦芽味”或者“黑醋栗芽苞”的味道[6]。另外DMS有一定毒性，低浓度的DMS会引起头痛、恶心和呕吐，高浓度DMS会对中枢神经系统有麻痹作用。

上世纪80年代，国外对啤酒中DMS展开研究，结果表明啤酒中的DMS有两个重要来源：1）大麦胚萌发过程中产生的甲基蛋氨酸（S-methylmethionine，SMM）热分解所得；2）酵母还原二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）得到DMS[3,7-9]。第1个途径主要发生在麦芽焙焦过程与麦汁煮沸过程中，第2个途径主要发生在发酵过程中。将SMM与DMSO统称为二甲基硫前驱体（dimethyl sulfide precursor，DMSP）。根据DMS的产生源头，控制啤酒中DMS含量主要通过两个途径[10]：1）通过选择低DMS前驱物含量的麦芽种类，控制煮沸时间、麦汁pH值与煮沸后高温等待时间调控SMM方DMS的转化；2）优选酵母菌株、调整麦汁浓度、氨基氮含量以及发酵罐类型、发酵温度调控DMSO还原为DMS的含量。

国内学者对啤酒中DMS含量的影响因素也进行了相应研究。温科[11]研究发现在制麦过程中添加赤霉素和溴酸钾可对DMS及DMSP表现出不同的抑制作用。王芝梅[12]研究表明国产大麦的SMM含量高于Cervoise大麦，制麦过程中发芽及干燥初期麦粒中的SMM含量处于增长的趋势。房慧婧等[13]对糖化煮沸及沉淀过程中DMS、SMM含量进行了研究，结果表明麦汁中的游离DMS在煮沸过程可降至最低，但澄清、冷却阶段又重新升高，SMM含量在麦汁制备过程中一直呈下降趋势。王德良等[14]研究了发酵过程中发酵液的DMS含量的影响因素，发酵温度、酵母代数、有害微生物对发酵液DMS含量有显著影响。

在国外，Sinclair等[15]和Bamforth[16]证明全麦芽的Lager啤酒中DMS含量高于Ale啤酒。这是由于Ale啤酒的麦芽焙焦温度比Lager啤酒的麦芽焙焦温度高，SMM热分解更为彻底[10]。但国内学者唐朝艳[17]抽取市场5 个啤酒样品，DMS质量浓度在21～29 μg/L，含量均低于阈值。国内市场大多的Lager啤酒由于添加了大米、糖浆、淀粉等辅料，反而使得Lager啤酒中的DMS含量大多在阈值以下。然而近年来，由于国内的消费升级，全麦芽的特色啤酒越来越受欢迎，啤酒使用全麦芽作为原料后容易导致DMS含量升高，甚至超出风味阈值，因此DMS含量变成了国内酿酒师酿造全麦啤酒时越来越受重视的一个重要风味指标。

本研究抽取国内15 个商品啤酒样品，对其DMS含量进行检测分析，对酿造过程中麦芽、麦汁、发酵液的DMS、SMM、DMSO含量变化过程进行详细研究，同时对啤酒生产过程中的DMS含量控制方法进行探讨。本实验对研究全麦啤酒酿造过程中DMS含量的上升原因、控制成品啤酒的DMS含量有参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

偏重亚硫酸钠（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；甲基乙基硫醚（＞96.0%）、DMS（＞99.7%）阿拉丁试剂有限公司；麦芽为随机抽取市售10 种样品，啤酒为随机抽取市售15 种啤酒样品。

1.2 仪器与设备

Clarus 500 GC气相色谱仪 美国PerkinElmer公司；DMA4500全自动啤酒分析仪 奥地利发东帕商贸有限公司；LXJ-IIB飞鸽离心机 上海发亭科学仪器厂；Buhler DLFU麦芽研磨机 麦科仪（北京）科技有限公司；Stomboil煮沸锅 德国克朗斯股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

麦芽处理参照Baldus[18]与Yang[19]等的方法。称取20.00 g麦芽（麦芽于4 ℃冰箱预冷12 h）于研磨机研磨得到麦芽粉于密封袋暂存。称取10.00 g研磨好的麦芽粉转移至250 mL碘量瓶，加入100 mL蒸馏水摇匀，室温下振荡摇匀35 min后转移至离心管（氮气排空10 s）中，50 000 r/min离心5 min，上清液加盖滤纸快速过滤，滤液用于样品检测。

麦汁取样后立即密封冷却至4 ℃，用单层滤纸加盖快速过滤后用于样品检测。啤酒样品冷却至4 ℃后直接进行检测。

1.3.2 麦汁煮沸

麦汁煮沸在带内加热器的Stom boil煮沸锅内完成，煮沸过程中不同时间麦汁温度、蒸汽耗用数据见表1。

表1 煮沸过程温度、蒸汽压力及蒸汽耗用数据Table 1 Temperature, steam pressure and steam consumption during the boiling process

1.3.3 DMS、SMM、DMSO的气相色谱-氢火焰离子化检测

DMS、SMM检测参考ASBC分析方法《顶空气相色谱法测定二甲基硫前体物质含量》[20]。DMSO检测参考Baldus分析方法[18,21]，氮吹清除游离DMS。

色谱柱：DB-WAX（0.53 mm×30 m，1.0 µm）；升温程序：37 ℃保持2.3 min，以10 ℃/min升至60 ℃，20 ℃/min升至120 ℃，30 ℃/min升至220 ℃，保持1 min；氢火焰离子化检测器，温度230 ℃，载气N2，流速8 mL/min，进样时间0.05 min。

1.3.4 三角瓶发酵实验

发酵实验在2 L三角瓶内进行，麦汁麦芽配比为60%大麦芽与40%小麦芽，麦汁浓度为10.2 °P，麦汁量为1 L，上面酵母接种，接种量为2×106CFU/mL，发酵温度为25 ℃，常压发酵。

1.3.5 大罐发酵实验

接种麦汁麦芽配比为60%大麦芽与40%小麦芽，麦汁浓度为12.2 °P，满罐麦汁总量400 m3，上面酵母接种，接种量为2×106CFU/mL。

1.4 数据分析

所有实验均重复3 次，用SPSS Statistics 22.0、Excel 2010统计分析数据并制图。

2 结果与分析

2.1 15 种市售啤酒的DMS含量

表2 市售啤酒样品的DMS含量Table 2 DMS contents of commercial beer samples

抽取国内15 个啤酒样品进行DMS含量检测，结果见表2。由结果得知，不同样品DMS含量差别较大，波动范围为20～105 μg/kg，与Liu Chunfeng等[22]检测14 种国内啤酒样品DMS含量结果49～102 μg/kg相近，同时Liu Chunfeng等[22]研究还得出国内DMS含量较低的啤酒更受欢迎的结论。本实验中15 个样品中有7 个样品超出阈值（60 μg/kg），品评部分有生青味，占总体抽检样品比例的47%，运用SPSS对数据进行相关性分析，结果表明啤酒DMS含量与啤酒类型之间呈显著相关性，相关系数0.538（P＜0.05），其中Lager啤酒中有25%超出阈值，Ale啤酒中有71%超出阈值。因此DMS含量应该是国内酿酒师关注的指标，特别是生产全麦芽的Ale啤酒。抽检样品中，8 个Lager啤酒样品DMS平均含量为46 μg/kg，7 个Ale啤酒样品DMS平均含量为72 μg/kg，Ale啤酒的DMS含量高于Lager啤酒，这与国外检测结果相反。国外检测Lager啤酒DMS含量高于Ale啤酒，其原因是在麦芽焙焦过程中，温度升高，SMM的总量减少，Ale啤酒麦芽的焙焦温度比Lager啤酒的麦芽焙焦温度高，SMM热分解更为彻底，麦汁中产生的DMS含量低于Ale啤酒，同时Ale啤酒一般采用高温发酵，导致最终Ale啤酒DMS含量低于Lager啤酒[10]。而在国内Lager啤酒麦汁原浓大多比Ale啤酒原浓低，且多数Ale啤酒使用全麦芽作为原料，未添加糖浆大米等辅料或添加比例较低。White[23]与孙军勇[24]等检测国内大米、糖浆辅料中不含有或含有极少量的DMS及DMSP，从而降低了成品Lager啤酒中DMS的含量，因此检测国内样品中Ale啤酒的DMS含量高于Lager啤酒。

2.2 市售麦芽DMS、SMM、DMSO含量

表3 市售不同麦芽样品的DMS、SMM、DMSO检测结果Table 3 DMS, SMM and DMSO contents of malts μg/g

抽取国内市场4 个厂家6 种澳麦芽品种、4 种国产小麦芽，检测DMS、SMM、DMSO含量。从表3中可以看出，澳麦芽DMS含量在1.55～4.03 μg/g范围内波动，这与Dickknson[25]测定的英国Lager麦芽与White等[26]测定的英国Julia Lager麦芽含量范围相符，但温科[11]制麦过程中的检测数据差别较大，与唐朝艳[17]的检测结果（0.15～1.36 μg/g）相近。Dickknson[25]测定的英国Lager麦芽DMS与SMM含量高于Ale麦芽，而DMSO含量Lager麦芽低于Ale麦芽，这与麦芽的焙焦温度、含氮量有关[10,19,27]。实验中6 个澳麦芽之间DMS含量波动较大，澳麦芽5是澳麦芽2的2.6 倍，澳麦芽6的SMM含量也达到澳麦芽2的2.09 倍。运用SPSS对数据进行相关性分析，结果表明麦芽SMM含量及DMSO含量与麦芽类型之间呈显著相关性，相关系数分别为0.420（P＜0.01）、0.831（P＜0.01）。而啤酒中的DMS含量主要受麦芽中SMM与DMSO含量影响较大[24]，因此同一生产工艺选用不同品种麦芽可造成定型麦汁DMS含量偏差较大，酿酒师在糖化生产前需特别关注大麦芽中的DMSO与SMM含量，根据含量不同调整糖化的生产工艺。美国、加拿大部分啤酒厂也已经把麦芽中DMS相关指标纳入标准，成品麦芽总DMS含量小于2 μg/g。除小麦芽4外其余麦芽DMS、SMM、DMSO含量均比澳麦芽含量低，所以选用合适的小麦芽品种、适当提高小麦配比可以降低定型麦汁的DMS含量。

2.3 煮沸时间对DMS、SMM、DMSO影响

图1 煮沸时间对麦汁DMS与SMM含量影响Fig. 1 Effect of boiling time on the contents of DMS and SMM in wort

图2 麦汁煮沸前后DMSO含量对比Fig. 2 Comparison of DMSO content of wort before and after boiling

研究10.2 °P麦汁在Stormboil煮沸锅中煮沸过程的DMS及SMM含量变化，如图1所示。煮沸的初始麦汁量为104.3 t，结束麦汁量为99.9 t，煮沸强度为4.2%，煮沸过程中未添加任何水，煮沸过程麦汁pH值控制在5.6，煮沸结束时调整pH值至5.5左右。从图1可以看出，DMS在前40 min内有一个快速的降低过程，40 min时达到30 μg/kg，降低92%，随后的20 min内降低速度减缓，整个过程中DMS降低速率远高于麦汁蒸发率，因为麦汁蒸发对DMS与SMM含量升高的影响可以忽略。DMS降低主要是因为DMS沸点只有38 ℃，在100 ℃高温情况下会快速蒸发，再加上Stormboil采用强制循环、增加麦汁挥发面积的煮沸方式，能够保证DMS的挥发速度大于SMM分解速度，从而起到快速降低麦汁中DMS的含量。

根据Scheuren等[3]的研究，SMM热分解符合提出的一级动力学反应Ct＝C0e-kt，Ct为SMM随时间变化的瞬时浓度，C0为初始浓度，参数k描述了与温度有关的反应速度。半衰期时间还与实际生产过程中麦汁煮沸时的压力有关[26-28]，实验在Stormboil煮沸锅中进行，煮沸过程中锅内压力为1 个大气压。运用Excel对图1中SMM含量在0～60 min内分解曲线进行模拟，趋势线指数函数为Ct=440.07e-0.023t（R²=0.990 7），此模型中模拟了SMM浓度与加热时间的关系，与Scheuren等[3]的一级动力学反应相符，由此可以计算SMM在100 ℃、pH 5.6时半衰期为31 min，与Dickenson[29]研究SMM在98.5 ℃的半衰期为30.5 min相符。

图2中DMSO含量煮沸开始至煮沸60 min结束增加了83%，说明煮沸过程中部分从DMS被氧化为DMSO。

2.4 麦汁沉淀过程DMS、SMM、DMSO含量变化

图3 麦汁煮沸结束至过料结束不同时间下DMS与SMM含量变化Fig. 3 Trends of DMS and SMM contents in boiled wort during precipitation

如图3所示，随着在高温区保留时间延长，SMM不断减少，DMS含量不断增加。煮沸结束至过料结束，麦汁温度始终保持在98 ℃以上，SMM在高于70 ℃温度下会继续热分解产生DMS[30]，而沉淀槽中的麦汁挥发面积较小，DMS被保留在麦汁中，导致DMS含量继续上升。SMM含量从煮沸结束至过料结束降低54 μg/kg，DMS增加量为40 μg/kg，74%的热分解产生的DMS被麦汁溶解。

图4 麦汁煮沸结束与沉淀结束DMSO含量对比Fig. 4 Comparison of DMSO content of wort after boiling and precipitation

如图4所示，在沉淀槽内停留40 min后DMSO只有小幅增加，总含量只增加了5%，沉淀过程中DMS少量被氧化。

2.5 三角瓶发酵过程DMS、SMM、DMSO含量变化

实验室内用高SMM含量的麦汁作为接种麦汁，添加上面酵母在三角瓶内进行常压发酵，研究酵母发酵过程的DMS、SMM、DMSO含量，结果如图5所示。在常压下啤酒中的DMS随发酵产生的CO2散失，而SMM被酵母作为氮源消耗，但是未见发酵液中DMS有明显上升，这由于SMM被酵母代谢而未产生活性DMS，这与Scheuren等[8]描述相符。DMSO含量在发酵第3天时有明显的上升趋势，这可能与DMS被氧化有关。文献[19,31]报道DMSO是啤酒中DMS的重要前驱物，Sugai等[32]研究发现在Lager酵母与Ale酵母中均能产生蛋氨酸亚砜还原酶，将DMSO还原为游离DMS，但两种酶的活性差别较大，不同的酵母菌株有不同的还原能力，而且酵母可利用氮源较少时DMSO被还原的量增多，发酵温度低比发酵温度高时酵母还原DMSO的量多[33-35]。实验中该酵母菌株未能将麦汁中的DMSO大量还原，这与实验用酵母菌种、麦汁氨基氮含量较高、上面发酵温度有关。

图5 三角瓶发酵过程DMS、SMM、DMSO含量变化Fig. 5 Trends of DMS, SMM and DMSO contents during fermentation

2.6 400 t发酵罐发酵过程DMS、SMM、DMSO含量变化

图6 400 t发酵罐发酵过程DMS含量与糖度变化Fig. 6 Trends of DMS content and gravity during fermentation in 400-t fermenter

如图6所示，1～2 d为麦汁满罐过程，前2 d满罐后DMS含量有上升趋势，2 d时达到最高值，为73 μg/kg。2 d后酵母进入厌氧发酵，糖度由11.6 °P快速降低为7.7 °P，发酵进入旺盛期，DMS随着CO2产生而挥发，下降速度较快，3 d时达到DMS最低值为43 μg/kg，为最高值的59%。Hansen等[35-36]报道61%～72%麦汁DMS都被发酵过程中的CO2洗涤排出罐外。3～7.5 d后随着糖度下降速度降低而趋于稳定。7.5 d后开始降温后贮，发酵后贮过程中DMS含量有升高趋势，啤酒降温后DMS溶解增高。酿酒师为了控制啤酒DMS含量，可以在发酵过程中适当推迟封罐时间，让DMS随之CO2而排出。

图7 400 t发酵罐发酵过程SMM、DMSO含量变化Fig. 7 Trends of DMSO and SMM contents during fermentation in 400-t fermenter

如图7所示，SMM含量在发酵初期有明显的下降趋势，这与本实验室得出的结论相符，部分硫甲基蛋氨酸被酵母代谢消耗，较峰值降低65%左右。DMSO含量前3 d稳定，这于Baldus等[7]研究相符，发酵期间前3 d DMSO含量稳定，3 d后少量的DMSO被还原为DMS，Baldus等[7]研究中第7天时6%的DMSO被还原，而这种还原受到限制，由于麦汁中存在着高浓度的蛋氨酸氧化硫，它是DMSO还原的强烈抑制剂。本实验3 d后观察到DMSO含量有升高趋势，其原因需要进一步验证。

3 结 论

DMS是啤酒中的重要风味指标，但GB 4927—2008《啤酒》[37]中未进行强制要求。本研究检测国内市场上常见的15 种啤酒样品的DMS含量，其中47%的抽检样品DMS含量超出60 μg/kg，因此DMS应该是国内酿酒师重点关注的指标，特别是国内全麦芽的Ale啤酒。

实验对国内市场10 个麦芽样品的DMS及DMSP进行检测，不同麦芽间DMS与DMSP差异较大，多数小麦芽的DMS与DMSP含量较澳麦芽低，因此酿酒师选用合适的小麦芽品种、适当提高小麦配比利于降低啤酒中的DMS含量。实验研究了麦汁煮沸及沉淀过程中的DMS及DMSP含量的变化，麦汁在100 ℃、pH 5.6时，煮沸0～40 min阶段DMS含量降低较快，40 min时达到30 μg/kg，SMM的半衰期为31 min，SMM分解动力学和DMS的挥发性可以用来计算和预测麦汁中DMS含量，是优化麦汁生产的有效工具，这给啤酒酿造师制定糖化工艺提供了理论依据。研究发酵过程中的DMS及DMSP含量变化，结果表明DMS在发酵旺盛期时有明显的下降趋势，麦汁中65%的SMM被酵母利用，酿酒师在控制DMS含量时可考虑适当延长发酵封罐时间，使更多的DMS排出罐外。