云南省大理白族自治州地中海贫血基因诊断结果分析

杨锡彤，杨宗梅，马蓉，徐弘扬，赵彩虹，王光明*

地中海贫血（thalaseemia，TM）是一种常染色体遗传性血液疾病，又称珠蛋白生成障碍性贫血，其原因是珠蛋白基因缺陷导致珠蛋白链合成障碍而引起的遗传性溶血疾病［1］。TM最常见的两种亚型是α-TM和β-TM。α和β珠蛋白基因位于不同的染色体上，α珠蛋白基因位于16号染色体短臂（16p13.3）靠近质粒端，β珠蛋白基因位于11p［2］。在全球范围内近5%的人群中存在珠蛋白变异，其中1.7%是TM携带者，每1万例新生儿中大约有4.4例是TM患儿［3］。TM尤其是重型TM不仅影响患儿的生活质量同时也加重社会的经济负担。我国南方地区是TM的高发区，其中广东、广西、云南省TM基因携带者高达总人口的11%～25%，以α和β珠蛋白生成障碍最为常见［4-5］。云南省是TM的高发地区，但大理白族自治州居民的流行病学情况不清楚，因此本研究通过对大理白族自治州6 120例样本进行基因诊断，其中多数为妊娠前和妊娠期检测，通过基因诊断结果对云南省大理白族自治州的TM患者进行系统分析，减少TM患儿的出生率，提高TM患者的生活质量，减轻社会经济负担。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2014年8月—2018年5月在大理大学第一附属医院、大理白族自治州人民医院做TM检查的6 120例受检者作为研究对象，其中妊娠前和妊娠期受检者4 690例（76.63%），临床血常规检查结果异常者1 430例（23.37%）。纳入标准：（1）患者基因分型为α-TM、β-TM、α和β混合型TM之一，无其他基因分型；（2）患者1年内无输血史；（3）患者对本研究调查的内容和目的均了解，并签署知情同意书。排除标准：（1）心、肝、肾功能不全；（2）除贫血外还患有其他类型的血液系统疾病；（3）患有精神类疾病或智力障碍等无法配合研究。

1.2 方法 采集受检者外周静脉血5 ml注入乙二胺四乙酸（EDTA-K2）抗凝管中，充分摇匀，采用TM检测试剂盒〔北京优讯公司，采用一代测序、实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）、PCR-反向点杂交法及跨越断裂点聚合酶链反应（Gap-PCR）等多种检测技术〕检测3种α缺失型（-α3.7、--SEA、-α4.2），3种突变型（αQSα、αCSα、αWSα），17种β突变型〔-28（A〉G）、-29（A〉G）、-30（T〉C）、-32（C〉A）、Be（GAG〉AAG）、Cap+40-43（A〉C、-AAAC）、CD14-15（+G）、CD17（AAG〉TAG）、CD27/28（+C）、CD31（-C）、CD41-42（-TTCT）、CD43（GAG〉TAG）、CD71-72（+A）、initiation condon（ATG〉AGG）、IVS- Ⅰ-1（G〉T/A）、IVS-Ⅰ-5（G〉C）、IVS-Ⅱ-654（C〉T）〕。具体步骤严格按照说明书操作。扩增反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性60 s，59.7 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s，共35个循环，最后72 ℃延伸5 min。

1.3 观察指标 患者的性别、年龄、TM的发生率、患病总比例、基因型比例，其中患病总比例=患病人数/总人数，基因型比例=各基因型患病人数/总患病人数，并根据各基因型TM患病人数分析云南省大理白族自治州TM的类型。

2 结果

6 120例受检者中男810例（13.24%）、女5 310例（86.76%），TM患者1 220例（19.93%）。1 220例TM患者中男90例（7.38%）、女1 130例（92.62%），妊娠前或妊娠期产检830例（68.03%），临床疑似TM患 者 390例（31.97%）；α-TM 560例（45.90%），其中α缺失型520例、α突变型40例，β-TM 660例（54.10%）。520例α缺失型中，孕产妇326例（62.69%），-α3.7缺失型360例、--SEA缺失型140例、-α4.2缺失型20例；40例α突变型中，孕产妇12例（30.00%），αCSα点突变30例、αWSα点突变10例；β突变型共17种，但本研究660例β突变型中只涉及 IVS- Ⅱ -654（C〉T）、Be（GAG〉AAG）、CD17（AAG〉TAG）、CD41-42（-TTCT）、CD43 （GAG〉TAG）、initiation condon（ATG〉AGG）、CD31（-C）、-28（A〉G）8种，其中孕产妇492例（74.54%），具体情况见表1。在α-和β-TM类型中出现20例α和β混合型TM，其中8例为-α3.7和Be（GAG〉AAG），男2例、女6例；5例为--SEA和IVS-Ⅱ-654（C〉T），均为女性；4例为αWSα和CD17（AAG〉TAG），男3例、女1例；3例为-α3.7和CD17（AAG〉TAG），均为男性。

3 讨论

TM是全球最常见的单基因疾病，每年有近7万名新生儿出生后患有不同类型的TM［6］。TM突变携带者的选择优势能对恶性疟疾有抑制作用，最初TM只发生在地中海地区，后来蔓延至非洲、南亚和东南亚地区。然而由于人口的迁移，TM变成了发达国家包括英国、加拿大和美国最重要的健康问题，也是全球的健康问题［7］。严重的TM不仅影响生活质量，还会给社会造成经济负担，因此在妊娠期对TM的筛查尤为重要。目前临床上主要以α和β两种类型的TM常见。α-TM是由于α珠蛋白相关的基因突变引起的α珠蛋白合成缺陷，目前已知的α珠蛋白相关的基因突变有100多种，而α-TM的严重程度取决于α珠蛋白功能性基因的数量［8］。β-TM是全球临床上最常见的血红蛋白疾病之一，目前的数据表明超过250种隐性基因能够引起基因突变导致β-TM，与α-TM不同的是，导致β-TM的多数突变是点突变而不是点缺失［9］。本研究通过对大理大学第一附属医院和大理白族自治州人民医院6 120例受检者进行TM检测，从而系统解析大理白族自治州TM的基因分型。本研究发现，3种缺失型α-TM类型均被检测到，但突变型只检测到了αCSα、αWSα突变型，αQSα突变型在本次检测中并没有出现。17种β突变型检测到8种，其中检测到的initiation condon（ATG〉AGG）突变型是临床较少见到的突变类型。本研究发现，云南省大理白族自治州α-TM以缺失型为主，β-TM较α-TM发生率高。

表1 TM检出结果Table 1 The result of thalaseemia detected

CD 17 （AAG〉TAG） （HBB：c.52A〉T）、CD 41-42（-TTCT） （HBB：c.126_129delCTTT）、-28 （A〉G）（HBB：c.-78A〉C）、IVS- Ⅱ -654 （C〉T） （HBB：c.316-197C〉T）、HbE（CD 26，G〉A） （HBB：c.79G〉A）、CD 71/72 （+A）（HBB：c.216_217insA）引起的突变在中国人群中占β-TM的90%［10］。本研究结果表明，大理白族自治州β-TM的人数多于α-TM的人数，相关研究表明β-TM患者的血红蛋白A2（HbA2）值明显增加［10］。与以往中国其他南方地区报道相比，云南省大理白族自治州TM的发生率（19.93%）比广西壮族自治区（24.51%）低，比广东省（11.07%）、云南省（9.7%）高［11-13］。在中国南方多数地区α-TM主要包括3种基因缺失类型（-α3.7、--SEA、-α4.2）和2种基因突变类型（αCSα、αWSα）［11-13］。本研究中也出现了3种缺失型和2种突变型，并没有出现αQSα突变型，而α-TM占TM的45.90%，在其他地区α-TM主要以--SEA缺失型发生率高，在广西壮族自治区为68.5%，广东省为48.5%，香港为89%［14］，但本研究中--SEA缺失型占α-TM的比例为26.92%（140/520），-α3.7所占比例为69.23%（360/520），因此本研究表明云南省大理白族自治州α-TM以-α3.7缺失型为常见类型，与之前ZHANG等［12］对云南省昆明市人群的研究结果不一致，其结果表明--SEA缺失型占α-TM的比例为59.2%，研究地区为云南省昆明市，而本研究地区为云南省大理白族自治州，两个地区的人口组成有差异，云南省大理白族自治州少数民族较多且以白族为主，因此可能是民族的差异性导致了最终结果的不同。与α-TM相比，多数β-TM由点突变导致β珠蛋白链合成中β+的减少或β0的完全缺失影响等位基因造成。本研究β-TM以Be（GAG〉AAG）发生率较高，而海南省和广西壮族自治区以CD41-42（-TTCT）发生率较高［15］。

TM检查为阳性患者，配偶需进行TM的检测，以避免重型TM患儿的出生，达到优生优育的目的。重型TM需要终身输血和铁螯合治疗缓解或通过异基因造血干细胞移植治疗，但输血治疗可能会引起多种并发症，定期输入红细胞导致铁超载会引起内分泌失调，慢性溶血和组织缺氧会导致多器官功能障碍［16］。虽然目前认为Crispr-相关蛋白9核酸酶（CRISPR-Cas9）是最主要的基因编辑工具，理论上CRISPR-Cas9可通过恢复珠蛋白基因的数量或减少珠蛋白基因表达，改善TM的严重临床症状。但目前关于诱导多能干细胞移植给患者安全性的问题尚需进一步研究［17］，因此妊娠前对TM的筛查具有重要意义。

本研究6 120例受检者中4 690例为女性妊娠前和妊娠期筛查，阳性患者830例，阳性率为17.70%，1 430例血常规检查结果异常临床疑似TM患者390例，阳性率为27.30%，因此综合数据TM的阳性率会有所增加。大理白族自治州居住人群多数为少数民族中的白族，且大理平均海拔为2 052 m，最高海拔为4 295 m，高海拔地区可以提高血红蛋白水平，是否是因为地区差异和人群构成不同而导致结果差异还需要进一步研究。

作者贡献：杨锡彤进行文章的构思与设计，撰写论文；王光明进行研究的实施与可行性分析，论文的修订，负责文章的质量控制及审校；杨宗梅、马蓉、赵彩虹进行数据收集；马蓉、徐弘扬进行数据整理；徐弘扬进行统计学处理；杨锡彤、徐弘扬进行结果的分析与解释；杨锡彤、王光明对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。