安徽省规模禽场高致病性禽流感血清学横断面研究与风险因素分析

刘 华 ，占松鹤，何长生，王 倩，杨庆琳，涂 健，宋祥军，祁克宗，朱良强

（1.安徽省动物疫病预防与控制中心，安徽合肥 230091；2.兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室，安徽合肥 230036）

高致病性禽流感（high pathogenic avian influenza，HPAI）一直是困扰全球养禽业发展的主要禽病之一，被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病[1-2]，我国将其列为一类动物疫病。2004年开始，H5亚型HPAI 被我国列为强制免疫和监测病种[3]。H7N9流感2013年首次被报道[4]，期初对家禽的致病性有限，后于2017年上半年变异为高致病性毒株，并在湖南、河南、河北、天津、安徽等地引发多起家禽疫情[5]。为此，农业农村部将H7亚型（H7N9株）与H5亚型（Re-8株）一并纳入强制免疫范围，并研发了重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5N1 Re-8株+H7N9 Re-1株）（以下简称“H5+H7”二价苗）用于集中免疫[6]。

为掌握安徽省禽群的禽流感免疫抗体水平以及引起免疫不合格的主要风险因素，在2018年春季集中免疫前，在安徽省7个市选择规模养禽场，采集家禽血清样品进行H5亚型（Re-8株）和H7N9亚型流感病毒抗体检测，并分析导致免疫不合格的主要风险因素，以期为决策部门制定免疫方案提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 目标群

根据往年国家禽流感参考实验室对安徽省的禽流感检测阳性结果，结合2018年春季政府采购“H5+H7”二价苗下发情况，选择宿州、阜阳、合肥、六安、滁州、宣城、芜湖7个市作为本研究的重点监测区域，将7个市的种禽场、蛋禽场（含蛋用和肉蛋兼用型）和肉禽场家禽作为目标群。

1.2 抽样策略和样本量

采取先抽取群体再抽取个体的抽样策略[7]。用估计流行率方法，设90%的群体抗体合格率（p）、95%的置信水平（CL）和5%的可接受误差（d），根据公式N=1.962×p（1-p）/d2计算，共需抽取140个场。根据安徽省畜牧业统计数据，按1：3：6的比例，确定种禽场、蛋禽场、肉禽场的抽取场数，然后随机抽取。按照估计流行率方法，预设90%的个体流行率、95%的置信水平和10%的可接受误差，在每个场内随机采集35份家禽血清样品。

1.3 问卷调查与采样检测

问卷设计考虑到与禽流感群体免疫抗体合格率相关因素，主要包括养殖场基本情况、免疫情况和周边环境等。由省级动物疫控中心召集被选养殖场所在县级动物疫病控制中心相关技术人员，开展问卷填写培训并统一采样要求，再由县级疫病控制中心负责现场调查和采样。每只家禽采血2 mL，2 500 r/min 离心取血清。依据国家标准（GB/T18936—2003）检测血清中的HI 抗体[8]。依据农业农村部规定（个体HI 抗体效价≥24为免疫合格，个体免疫抗体合格率≥70%，为免疫合格群体）[9]，设定H5亚型（Re-8株）和H7亚型（H7N9 Re-1株）禽流感病毒群体免疫抗体合格率均≥70%，为免疫合格场，任一项低于70%，为免疫不合格场。

1.4 数据分析

1.4.1 群体免疫抗体合格率计算一般情况下，群体表观免疫抗体合格率（HAp）为检测到的免疫抗体合格群占抽样研究群的比值。对分层得到的群体免疫抗体合格率进行直接标准化计算后[7]，将其与试验敏感性（Se）、特异性（Sp）、个体抽样数量（n）一起带入公式HSe=1-[1-p×Se-（1-p）×（1-Sp）]n，HSp=Spn和HTp=（HAp+HSp-1）/（HSe+HSp-1），计算群敏感性（HSe）、群特异性（HSp）和群体真实免疫抗体合格率（HTp）。

1.4.2 统计方法将与禽流感群体免疫抗体不合格的相关风险因素，包括养殖场地理位置、类型、家禽种类、存栏量、周边环境和免疫情况，用Excel 录入相关数据后，用SPSS 20.0软件，对分类有序变量进行点二列相关系数分析、描述统计和哑变量二元Logistic 回归分析，对分类无序变量进行哑变量二元Logistic 回归分析；对二分类变量，用Epi Info 7软件进行单因素回归分析。

2 结果

2.1 场群抗体合格率/阳性率

血清学检测结果显示，安徽省7市的H5亚型（Re-8株）和H7亚型（H7N9 Re-1株）禽流感的场群表观抗体合格率/阳性率分别为72.9%和52.1%。将各层血清学结果按所占比例进行加权计算，得二者标准化率分别为69.5%和49.5%（表1）。设禽流感HI 试验敏感性Se=98.8%，特异性Sp=99.5%[10]，计算得出HSe 和HSp 分别为100%和83.9%；继而计算得出，安徽省7市H5亚 型（Re-8株）和H7亚 型（H7N9株）禽流感场群真实抗体合格率/阳性率分别为67.7%（95%CI：60.0%～75.4%）和39.8%（95%CI：31.7%～47.9%）。

表1 禽流感抗体场群免疫合格率/阳性率

2.2 风险因素的点二列相关分析

将有关风险因素作为自变量，免疫不合格作为因变量，用SPSS 20.0软件，对分类有序变量（近似正态分布）进行点二列相关分析[11]。结果（表2）显示，存栏量、家禽日龄、禽流感疫苗免疫次数、免疫后天数等因素，与H5或H7亚型免疫抗体不合格呈负相关，其中存栏量越小（P=0.046）、免疫次数越少（P=0.016），H5或H7免疫抗体不合格（＜70%）的可能性越高（P＜0.05），但与家禽日龄、禽流感疫苗免疫后天数没有显著的相关性（P＞0.05）。

2.3 风险因素（分类有序变量）二元Logistic回归分析

表2 点二列相关性分析结果

根据SPSS 20.0软件的统计描述和频数分布结果，对存栏量、家禽日龄、禽流感疫苗免疫次数、免疫后天数4个分类有序变量进行分组、哑变量设置和二元Logistic 回归分析[11]，结果见表3。

表3 二元Logistic 回归分析结果（分类有序变量）

2.3.1 不同存栏量结果显示，在α=0.05的检验水准下，回归系数检验P值均＜0.05，提示其他3组的H5或H7禽流感免疫不合格风险均与≤4 000羽的禽场之间存在统计学差异。相对于参照组，其OR 和95%CI 分别为0.35（0.13～0.95）、0.22（0.08～0.61）、0.14（0.05～0.40），提示存栏量4 000羽以上养禽场的禽流感免疫不合格风险均显著低于≤4 000羽的禽场。

2.3.2 不同家禽日龄 81～220日龄家禽场的H5或H7亚型免疫不合格风险与≤26日龄的场之间存在统计学差异。相对于参照组，其OR（95%CI）为0.29（0.11～0.80），提示家禽日龄在81～220之间的养禽场的免疫不合格风险显著低于≤26日龄的场，其他日龄与之差异不显著（P＞0.05），且OR 没有意义（95%CI 穿过1）。

2.3.3 不同免疫次数禽流感疫苗免疫次数≥2的禽场，其H5或H7亚型免疫不合格风险与没有免疫的禽场之间存在统计学差异。相对于参照组，其OR（95%CI）为0.22（0.08～0.60），提示免疫次数≥2的养禽场的禽流感免疫不合格风险显著低于没有免疫的场（P＜0.05）。而免疫1次的场与没有免疫的之间差异不显著（P＞0.05），且OR没有意义（95%CI 穿过1）。

2.3.4 不同免疫后时间免疫后22～60 d、61～90 d的H5或H7亚型免疫不合格风险与没有免疫禽的场之间存在统计学差异（P＜0.05），相对于参照组，其OR（95%CI）分别为0.29（0.10～0.87）、0.24（0.08～0.69），提示免疫后22～60 d 和61～90 d的免疫不合格风险显著低于没有免疫的场。免疫后≤21 d 或≥91 d 的禽场，与没有免疫的场之间差异不显著（P＞0.05），且OR 没有意义（95%CI穿过1）。

2.4 连续变量二元Logistic 回归分析

对地区、养殖场类型、家禽种类3个分类无序变量进行哑变量设置和二元Logistic 回归分析，结果见表4。

表4 二元Logistic 回归分析结果（分类无序变量）

2.4.1 不同地区皖中和皖南地区禽场的H5或H7亚型免疫不合格风险与皖北地区之间没有统计学差异（P＞0.05），且OR没有意义（95%CI穿过1）。

2.4.2 不同养殖场类型种禽场和蛋禽场的H5或H7亚型免疫不合格风险均与肉禽场之间存在统计学差异，相对于参照组，其OR（95%CI）分别为0.42（0.20～0.89）和0.27（0.09～0.77），提 示种禽场和蛋禽场的禽流感免疫抗体不合格风险均显著低于肉禽场（P＜0.05）。

2.4.3 不同家禽种类规模鸡场和鸭场的H5或H7亚型免疫不合格风险均与规模鹅场之间存在统计学差异（P＜0.05），相对于参照组，其OR（95%CI）分别为0.42（0.20～0.89）和0.27（0.09～0.77），提示规模鸡场和鸭场的禽流感免疫不合格风险均显著低于规模鹅场。

2.5 风险因素（二分类变量）单因素回归分析

用Epi Info 7软件，对周边3 km 范围内环境，包括是否有其他养殖场、是否有家禽交易市场或农贸市场、是否有家禽屠宰场、是否有野禽栖息地，以及是否使用“H5+H7”二价苗等风险因素进行单因素分析。结果显示，周边3 km 范围内有野禽栖息地的养禽场，其H5或H7亚型免疫抗体不合格风险是周边没有野禽栖息地的2.79倍（95%CI：1.10～7.65），没有使用“H5+H7”二价苗的养禽场，其免疫不合格风险是已使用过的2.66倍（95%CI：1.34～5.35），且有统计学意义（P＜0.05）。周边3 km 范围内有其他养殖场、交易市场或农贸市场、屠宰场与没有的差异不明显，没有统计学意义（P＞0.05），且OR 没有意义（95%CI 穿过1）。具体结果见表5。

表5 单因素分析结果（二分类变量）

3 分析与讨论

2017年下半年农业农村部推荐使用重组禽流感病毒“H5+H7”二价灭活疫苗实施强制免疫后，安徽省便开展了免疫抗体监测。2017年11—12月，H5亚型（Re-8株）和H7N9的场群免疫合格率分别为78.5%（416/530）和49.1%（256/521），个体水平分别为95.1%和68.0%。分析发现，中小规模场没有及时更换为“H5+H7”二价苗，并且没有强制要求在水禽场中使用。本次横断面研究发现，2018年4—5月，H5亚 型（Re-8株）和H7N9的场群免疫抗体合格率分别为67.7%和39.8%，表明场群免疫抗体保护率下降幅度非常明显。因此，开展春季集中免疫是一项必要和及时的工作。

在不考虑饲养管理水平、疫苗是否冷链管理、注射疫苗操作是否规范等主观因素影响情况下，对养禽场自身客观因素与禽流感免疫不合格之间的关联性进行统计分析，结果发现养禽场规模、类型，以及饲养家禽种类、是否使用了“H5+H7”二价灭活疫苗、禽流感疫苗免疫次数、养禽场周边3 km范围内是否有野禽栖息地等，均与禽流感的群体免疫抗体合格率有显著相关性。

据调查，由于大规模禽场、种禽场、蛋禽场多数遵循自己的免疫程序，疫苗选择的自主性更强，疫苗毒株的匹配程度和更新效率相对较高，因此免疫不合格风险相对较低。但是，在中小规模养禽场中，受自身条件、防疫意识等因素影响，养殖户对疫苗投入成本增加，以及注射疫苗可能引起料肉比变化、采食量降低、产蛋量下降等免疫不良反应，顾虑重重，因而对政府采购疫苗有所抵触。近年来，村级防疫员队伍的弱化更加剧了禽流感免疫“死角”的出现。本研究表明，没有使用“H5+H7”二价灭活疫苗养禽场的免疫不合格风险是使用过的2.66倍。这就要求相关部门在制定强制免疫计划时，应视情况进行分类指导，重点关注中小规模场、饲养周期短的禽场以及水禽场，加强对养殖户的宣传教育和技术指导，提高养殖户对政府采购疫苗的信心，在疫苗补贴政策上给予适度倾斜，使其做到“应免尽免”，不留“死角”。

根据疫苗使用说明，免疫禽流感灭活疫苗后21 d 产生的抗体才能达到保护水平，本次研究也证明了这一点。相对于没有免疫的禽场，免疫后22～90 d 是抗体检测的最佳时间段，维持70%的保护水平可达到90 d。养殖主体应配合当地兽医部门加强监测，对不合格的场实时进行补免；对饲养周期较长的养禽场，可以在第1次免疫后3个月以内进行二次免疫，以增加免疫次数，可延长免疫保护期。

根据单因素回归分析结果，周边3 km 范围内有野禽栖息地养禽场的禽流感免疫不合格风险是周边没有野禽栖息地的近3倍，提示野禽在禽流感向家禽传播过程中扮演着重要角色[12]，因此在养禽场选址时，应尽量避开野禽栖息地。

4 结论

本次调查发现：2018年春季安徽省7个市的H5和H7亚型场群抗体合格率下降幅度明显，近一半的养禽场抗体未达标（＜70%），因此需要及时开展春季集中免疫。养禽场规模、类型以及家禽种类、是否免疫、免疫次数、养禽场周边是否有野禽栖息地等，均与禽流感免疫抗体合格率显著相关，因此在制定强制免疫计划时，应视情况进行分类指导，同时要加强免疫抗体监测，实时开展补免或增加免疫次数；在养禽场选址时，应尽量避开野禽栖息地。