红景天苷对急性胰腺炎大鼠胰腺损伤的影响及其机制

赵琳，陈莎燕，蔡旺，张爱民，常艳敏

(天津市南开医院，天津300010)

急性胰腺炎(AP)是一种由于胰酶在胰腺内被激活而引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应性疾病。转化生长因子(TGF)β1是启动胰腺损伤修复的重要细胞因子[1]，但大量的TGF-β1将导致胰腺组织纤维化[2]。研究证实，TGF-β1必须与其特定细胞膜受体TGF-β1Ⅱ型受体(TβRⅡ)和TGF-β1Ⅰ型受体(TβRⅠ)结合，形成TβRⅡ-TGFβ1-TβRⅠ三聚体复合物，进一步激活位于胞质的Smads。Smads进入细胞核内与靶基因上特异性反应元件结合，启动相应靶基因如Ⅰ型胶原(ColⅠ)的转录，发挥组织修复功能[3]。传统中药红景天有益气活血、通脉平喘、清热解毒等作用，在临床多用于心脑血管疾病的辅助治疗[4]。红景天苷是红景天的主要活性成分，已有研究证实，红景天苷能改善大鼠AP早期胰腺微循环、降低胰酶水平、清除炎症因子[5]，但其作用机制有待进一步阐明。2018年9月～2019年3月,本研究制作了AP大鼠模型，观察红景天苷对胰腺损伤的影响并从TGF-β1/Smad3信号通路角度探讨作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要材料 SPF级雄性Wistar大鼠144只，体质量(220±10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。牛磺胆酸钠购自美国Sigma公司。红景天苷购自上海麦克林生物科技公司。ColⅠ ELISA检测试剂盒购自美国Uscnlife公司。总RNA提取试剂、逆转录试剂盒和Real-time Master Mix购自北京Tiangen公司，待测基因引物由上海生工生物工程有限公司合成。荧光定量PCR检测系统为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 动物分组、模型制作、给药及标本获取 144只大鼠随机分为对照组、模型组、治疗组，每组48只。模型组和治疗组大鼠采用胆胰管逆行注射2.0%牛磺胆酸钠建立AP模型：术前禁食、不禁水12 h，麻醉、腹部剪毛备皮，于腹壁正中作长约2 cm切口；入腹后沿幽门找到十二指肠，寻找胆胰管在十二指肠开口(乳头处)，用5号针头穿刺胰胆管开口对侧十二指肠壁后，持静脉留置针导管逆行插入胆胰管内1.0 cm，接匀速注射器，以0.15 mL/min速度注射2.0%牛磺胆酸钠(0.1 mL/100 g)，在此期间用无损伤小血管夹夹闭胰胆管近肝端暂时阻断胆汁流出；观察胰腺水肿、充血等改变，然后去血管夹、拔管；无损伤线缝扎十二指肠穿刺口的浆肌层，十二指肠复位，缝合切口，关腹。对照组开腹、置管操作同上，改为注入生理盐水。治疗组造模后即刻经腹腔注射红景天苷4.0 mg/kg、2次/d，模型组和对照组分别静脉注射等量生理盐水。每组分别于造模后6、12、24、48、72、96 h各取8只大鼠，消毒麻醉后打开腹腔，经腹主动脉取血，1 000 g离心15 min，留取血清，-80 ℃保存；切取造模后6 h胰腺组织行HE染色，其余于-80 ℃保存备用。

1.3 血清淀粉酶水平检测 采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清淀粉酶水平。

1.4 胰腺组织病理学观察 各组胰腺组织用4.0%甲醛固定，石蜡包埋，3 μm厚度连续切片，常规HE染色，在光学显微镜下观察肠黏膜组织病理改变，并根据Spormann标准[7]进行组织病理学评分。

1.5 胰腺组织中ColⅠ检测 取各组冻存胰腺组织100 mg，加入裂解液1 mL，匀浆后采用ELISA法按试剂盒说明检测ColⅠ。

1.6 胰腺组织中TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA检测 取各组胰腺组织80 mg加入1 mL TRIzol匀浆，按试剂盒说明提取总RNA。经纯度鉴定和浓度测定后，取1.0 μg总RNA行逆转录。取1.0 μL的cDNA进行PCR反应。TGF-β1mRNA上游引物序列为5′-CTCAACACCTGCACAGCTCC-3′，下游引物序列为5′-AGTTGGCATGGTAGCCCTTG-3′；TβRⅡ mRNA上游引物序列为5′-CCCTACTCTGTCTGTGGATGA-3′，下游引物序列为5′-GACGTCATTTCCCAGAGTAC-3′；Smad3 mRNA上游引物序列为5′-AGCGAGTTGGGGAGACAT-3′，下游引物序列为5′-AGTTGGGAGACTGGACGA-3′；内参β-actin上游引物序列为5′-TTGTATAACCAACTGGGACGATATGG-3′，下游引物序列为5′-GACTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3′。以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 各组血清淀粉酶水平比较 模型组造模后12 h淀粉酶水平到达最高值，各时点淀粉酶水平均高于对照组(P均<0.05)。治疗组造模后6、12、24、48 h高于对照组，造模后各时点淀粉酶水平均低于模型组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠造模后不同时点血清淀粉酶水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05，与模型组比较，▲P<0.05。

2.2 各组胰腺组织病理学评分比较 造模后6 h，模型组大鼠胰腺组织可见明显间质水肿、炎细胞浸润、腺泡细胞坏死，治疗组组织病理改变较模型组减轻。见图1。治疗组、模型组、对照组组织病理学评分分别为(8.1±2.8)、(12.7±2.4)、(1.4±0.2)分，治疗组和模型组高于对照组，治疗组低于模型组(P均<0.05)。

图1 三组大鼠造模后6 h胰腺组织病理情况(HE染色，200×)

2.3 各组胰腺组织中ColⅠ含量比较 模型组ColⅠ含量于造模后12 h升高，24 h一过性下降，在48 h再次升高，至96 h仍保持升高状态，造模后各时点胰腺组织中ColⅠ含量均高于对照组(P均<0.05)。治疗组造模后6、12、24、48、72 h ColⅠ含量高于对照组，造模后12、48、72、96 h ColⅠ含量低于模型组(P均<0.05)。见表2。

2.4 各组胰腺组织中TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA表达比较 模型组胰腺组织中TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA表达于造模后12 h升高，24 h下降，48 h再次升高并保持高水平，造模后12、24、48、72、96 h TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA相对表达量均高于对照组(P均<0.05)。治疗组造模后12、24、48、72 h胰腺组织中TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA相对表达量高于对照组，造模后12、48、72、96 h TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA相对表达量低于模型组(P均<0.05)。详见表3。

表2 三组大鼠造模后不同时点胰腺组织中ColⅠ含量比较

注：与对照组比较，*P<0.05;与模型组比较，▲P<0.05。

3 讨论

AP后胰腺修复机制尚不清楚，大多数学者认为胰腺损伤和修复同时存在。在各种致病因素导致胰腺损伤时，腺泡细胞、炎症细胞、胰腺星状细胞等分泌TGF-β1、血小板来源生长因子BB(PDGF-BB)、TNF-α、和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)等细胞因子，激活TGF-β1/Smad3、MAPK信号通路，上调ColⅠ、Ⅲ型胶原、纤连蛋白等基因表达，促进细胞外基质的合成和分泌，参与胰腺损伤的修复。但如果持续分泌大量的细胞因子，将导致胰腺纤维化[8～10]。

TGF-β1/Smad3信号通路在启动胰腺修复损伤、胰腺纤维化过程中起重要作用[11]。在AP早期，TGF-β1/Smad3信号通路即被激活，合成细胞外基质，参与胰腺损伤的修复；如果损伤因素持续存在，TGF-β1/Smad3信号通路就会持续处于激活状态，此时胰腺损伤与修复并存。本研究观察到AP模型组大鼠胰腺组织TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA表达有两次升高，一次在造模后12 h短暂升高即下降，另一次是在造模后48 h并保持高水平状态。这种变化趋势与胰腺组织中ColⅠ含量变化趋势一致，而不同于血清淀粉酶水平的变化趋势，提示激活TGF-β1/Smad3信号通路，促进胶原蛋白等细胞外基质合成，有助于胰腺组织损伤修复，从而减少了腺泡细胞的持续破坏。但本研究尚不能解释TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA表达有两次升高这一现象。

表3 三组大鼠造模后不同时点胰腺组织中TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA表达比较

注：与同时点对照组比较，*P<0.05，与同时点模型组比较，▲P<0.05。

红景天为景天属植物，属药食同源，在临床应用上有着悠久的历史。《神农本草经》中将红景天列为上品：“治大热，火疮，身热烦，邪恶气”[12]。红景天苷是红景天的主要活性成分，近年研究证实红景天药理作用广泛，有抗炎、抗肿瘤、减轻心脏损伤和肾脏损伤等功效[13～16]。还有研究发现，红景天苷能降低低氧性肺动脉高压大鼠的肺动脉压及颈动脉压，下调肺组织中IL-6、TNF-α等炎症因子表达，减轻肺组织病理损伤[17]。本研究发现，在AP模型制备后72 h，红景天苷治疗组大鼠淀粉酶水平已恢复正常，治疗组胰腺组织病理评分和ColⅠ含量低于模型组。这提示红景天苷能促进胰腺损伤修复，减轻胰腺腺泡破坏。本研究对红景天苷的作用机制进行了初步探讨，结果显示，治疗组造模后12、48、72、96 h TGF-β1、TβRⅡ、Smad3 mRNA相对表达量低于模型组，推测红景天苷的作用与抑制TGF-β1/Smad3信号通路过度激活有关。目前大多数研究认为，TGF-β1/Smad3信号通路过度激活除可导致胰腺纤维化，还是导致肝脏、肺脏等器官纤维化的重要原因[18]。红景天苷可能通过调控TGF-β1/Smad3信号通路来抑制器官纤维化，但这一作用有待进一步证实。

综上所述，本研究发现，红景天苷可减轻AP大鼠胰腺损伤，并有助于损伤修复，作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad3信号通路持续激活有关。