IgA肾病患者肾组织中鞘氨醇激酶1及α-平滑肌肌动蛋白表达观察

刘佳丽，李沁芸，杨琨，刘晓惠

(1川北医学院，四川南充637000；2川北医学院附属医院)

IgA肾病(IgAN)是我国常见的原发性肾小球疾病，30%～40%的IgAN患者表现为慢性进展病程，15%～20%的IgAN患者在发病10～20年后逐渐发展为终末期肾病(ESRD)[1，2]。IgAN发病机制尚不完全清楚，有研究表明系膜区IgA及其免疫复合物的沉积与异常糖基化、氧化应激、先天免疫等有关，并且IgA沉积伴随系膜细胞增生，与肾小球的病理变化相一致[3～6]。因此，多种原因引起的肾小球系膜细胞增殖是IgAN的一个重要病理标志。近年来，鞘氨醇激酶1(SphK1)在肾病中的作用备受关注，其与系膜细胞增殖有关。SphK是一种高度保守的脂类激酶，有SphKl和SphK2两种细胞亚型。SphK1催化鞘氨醇(Sp)生成1-磷酸鞘氨醇(S1P)。S1P与受体结合后激活下游信号通路发挥调节细胞增殖活性、细胞运动活性等作用。研究发现，IgAN小鼠模型肾皮质中SphK1、S1P高表达，并且与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达呈正相关[7]。α-SMA是系膜细胞被激活、由静止表型向增殖表型转化的重要标志蛋白之一[8]。因此，SphK1与α-SMA的相关性提示SphK1可能在IgAN系膜细胞增殖过程中发挥着重要作用。本研究观察了IgAN患者肾组织中SphK1、α-SMA的表达变化，并分析SphK1与α-SMA及肾功能指标的相关性，探讨SphK1在IgAN发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 组织来源 选取2014年10月～2016年6月在川北医学院附属医院肾内科住院、行肾穿刺病理检查确诊为IgAN的患者18例，其中男10例、女8例，年龄18～53岁，中位年龄32.5岁，取病肾组织纳入实验组。实验组血肌酐(77.35±27.24)μmol/L，尿素氮(6.35±0.86)mmol/L，24 h尿蛋白(2 094.37±1 893.55)mg/L。同期行手术治疗的肾癌患者5例，男3例、女2例，年龄37～43岁，中位年龄38岁，取病理证实的癌旁正常肾组织纳入对照组。排除糖尿病肾病、紫癜性肾炎等继发性肾小球疾病患者，干燥综合征、硬皮病等其他自身免疫性疾病患者，近6个月内使用免疫抑制剂、肾毒性药物及激素者。本研究符合医院伦理委员会要求，所有入选患者均签署知情同意书。两组患者的性别、年龄资料具有可比性。两组肾组织通过固定、漂洗、脱水、浸蜡、包埋后制成4 μm厚切片，所有切片中肾小球数目不少于5个。将石蜡切片放置于4 ℃冰箱保存。

1.2 肾组织中SphK1、α-SMA检测 采用免疫组化法。取两组组织标本，37 ℃下二甲苯脱蜡10 min×2次。100%、95%、85%、75%梯度乙醇水化，再用蒸馏水冲洗3 min。将切片放置3%H2O2中，室温25 min，以封闭内源性过氧化氢酶，蒸馏水冲洗约3 min。将切片置于枸橼酸钠修复液(pH 6.0)中，高温高压抗原修复3 min(在高压锅中水煮沸后再放切片至修复液中)，压力锅离开热源，放置10 min后用自来水冲洗使之冷却，去阀开盖，室温放置20 min自然冷却。PBS冲洗3次，每次3 min。去PBS液，每张切片滴加适当稀释的一抗(SphK1 1∶200，α-SMA 1∶300)1滴(约50 μL)，4 ℃过夜(16～18 h)。4 ℃过夜后无需冲洗，直接置入37 ℃恒温箱复温30～40 min，PBS冲洗3次，每次5 min。除去多余的PBS液，每张切片滴加非生物素标记的二抗1滴(约50 μL)，37 ℃下孵育15 min。PBS冲洗3次，每次5 min。每张切片滴加新鲜配置的DAB 1～2滴，室温下显色5 min。苏木素复染约1 min，自来水冲洗，用1%盐酸分化，氨水返蓝，再以梯度乙醇75%、85%、95%脱水，放置通风处晾干。中性快贴树胶封片，显微镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照。SphK1、α-SMA阳性表达以细胞质出现棕色或棕红色颗粒为标志，不着色为阴性。用Image Pro Plus图像分析软件进行分析，用HIS模式将阳性目标从背景中分离出来，用平均光密度值(IOD值)代表目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组肾组织中SphK1、α-SMA表达比较 实验组肾组织中SphK1、α-SMA相对表达量分别为34.73±7.37、44.47±8.51，对照组分别为18.65±2.30、19.85±2.96，实验组SphK1、α-SMA相对表达量均高于对照组(P均<0.05)。见图1。

注：A、B分别为实验组、对照组肾组织中SphK1表达情况；C、D分别为实验组、对照组肾组织中α-SMA表达情况。

图1两组肾组织中SphK1、α-SMA表达情况(IHC染色，200×)

2.2 实验组SphK1表达与α-SMA及肾功能指标的相关性 Pearson相关分析结果显示，实验组SphK1表达与α-SMA表达、24 h尿蛋白、血肌酐水平呈正相关(r分别为0.61、0.70、0.51，P分别为0.007、0.001、0.029)；SphK1表达与尿素氮水平无直线相关关系(r=0.13，P=0.600)。见图2～5。

图2 IgAN患者肾组织SphK1表达与α-SMA表达的相关性

图3 IgAN患者肾组织SphK1表达与24 h尿蛋白水平的相关性

图4 IgAN患者肾组织SphK1表达与血肌酐水平的相关性

3 讨论

多种原因引起的肾小球系膜细胞增殖是IgAN的一个重要病理标志。近年来，多项研究对SphK1在肾病中的作用进行了探索，认为其与系膜细胞增殖有关。Obinata于1998年首次从大鼠肾脏纯化提取出SphK[9]，其在人体中存在两种细胞亚型，即SphKl、SphK2。SphK1促进细胞存活并抑制细胞凋亡，SphK2的作用则相反。研究发现，SphK1/S1P可刺激肾小球系膜细胞增殖[10]。Katsuma等[11]在IgA小鼠肾组织中发现SphK1及S1P高表达，S1P与表面受体S1PR2结合后通过高敏G蛋白途径刺激系膜细胞增生。结合既往研究结果，我们推测SphK1可能在IgAN系膜细胞增殖过程中发挥着重要作用。

图5 IgAN患者肾组织SphK1表达与尿素氮水平的相关性

本研究通过免疫组化法检测了IgAN患者肾组织中的SphK1，结果显示，实验组肾组织中SphK1表达水平高于对照组。这提示IgAN发病过程中可能有SphK1的参与，与IgAN小鼠相关研究结果一致。除此之外，本研究结果还显示，IgAN患者肾组织中α-SMA表达升高，SphK1与α-SMA表达呈正相关。α-SMA是肌成纤维细胞的标志性蛋白，在肾脏纤维化进展中发挥重要作用。近年来，有学者在IgAN小鼠肾组织中发现，系膜细胞增殖活跃时，大量分泌系膜基质，表现为增殖-分泌型，α-SMA表达阳性；而且，随着系膜细胞增殖，细胞内SphK1表达增加，与α-SMA呈正相关[12]。本研究结果与上述研究相一致，提示SphK1、α-SMA均与系膜细胞增殖密切相关，SphK1可能在IgAN肾小球系膜细胞表型改变的过程中有一定作用。

为进一步探索SphK1与IgAN的关系，我们对IgAN患者肾组织中SphK1表达与24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮水平的相关性进行分析，结果发现SphK1与24 h尿蛋白、血肌酐呈正相关，与尿素氮无直线相关关系。24 h蛋白尿及血肌酐是预测及评估肾功能损害严重程度的重要指标[13，14]。本研究结果提示，SphK1表达水平在一定程度上可反映肾脏损害程度。本研究中SphK1表达与尿素氮水平无直线相关关系，其原因可能与尿素氮本身性质有关。尿素氮是体内蛋白质的分解产物，其血清水平受高蛋白饮食、高分解代谢状态等多种因素影响，波动性较大。

综上所述，本研究发现，IgAN患者肾组织中SphK1、α-SMA高表达，且SphK1表达与α-SMA表达、24 h尿蛋白、血肌酐水平存在相关性。SphK1可能参与了IgAN的发病，并与肾脏损害程度有关。然而本研究样本量较少，今后还需加大样本量进一步证实SphK1与IgAN发病的关系，并进行相关机制探讨。