类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中miR-21表达变化及其意义

董小敏，张瑞，郭粉玲，马亚萍

(咸阳市中心医院，陕西咸阳712000)

类风湿关节炎(RA)是一种常见炎症性自身免疫疾病，临床主要表现为关节功能障碍，致残率较高，严重影响患者生活质量[1]。RA发病原因较为复杂，主要是机体获得性免疫应答失调，引起免疫功能异常[2]。目前治疗RA的目标是缓解临床症状、降低疾病活动度，其中超敏C反应蛋白(hs-CRP)、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(CCP)、红细胞沉降率(ESR)等是临床诊断及评价RA活动度的常用指标。miRNA在调控细胞增殖、分化、凋亡等方面具有重要作用[3]。研究表明，miR-146a在RA患者中表达异常，促进RA活动期的发展[4]。还有研究发现，miR-21在RA患者中的表达与Th17/Treg失衡有关，但针对miR-21与RA疾病活动度关系的研究较少。因此，本研究观察了RA患者外周血单个核细胞(PBMC)中miR-21的表达变化，并分析其与疾病活动度的关系，以期为RA的治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年12月～2018年12月在我院接受治疗的RA患者102例纳入研究[5，6]。其中男45例，女57例；年龄18～75岁，中位年龄55.07岁；RA活动期60例(活动期组，活动期初发的RA患者DAS评分>3.2)、缓解期42例(缓解期组)。排除合并其他自身免疫系统疾病者，合并肝、肾、心脏功能障碍等严重疾病者，合并肿瘤、感染性疾病者，不配合医生治疗者。选择同期在本院健康体检的志愿者50例作为对照组，男21例、女29例，年龄20～76岁、中位年龄54.59岁。各组受试者性别、年龄具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准,受试者均自愿签署知情同意书。

1.2 标本获取与处理 采集所有受试对象入院24 h内清晨空腹静脉血6 mL分为2个管，一管室温静置1 h，4 000 r/min离心10 min，吸取上层血清分装于无菌EP管中，置于-20 ℃冰箱中保存待测；一管分离外周血PBMC。

1.3 外周血PBMC中miR-21检测 采集血液经肝素抗凝，加入等体积PBS混匀;Ficoll淋巴细胞分离液离心分层，吸取外周血PBMC于离心管中;PBS洗涤3次，收集贴壁细胞置于含10%～20%胎牛血清培养液中培养。提取总RNA，检测其浓度和纯度。将RNA反转录为cDNA并进行qRT-PCR反应。以U6为内参。miR-21上游引物序列为5′-AGCTGGGTAGCTTATCAGACTGAT-3′，下游引物序列为5′-ACTGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6上游引物序列为5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列为5′-GCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反应条件为94 ℃预变性60 s,94 ℃ 45 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt表示miR-21的相对表达量。

1.4 疾病活动度相关指标检测 采用免疫比浊法检测血清hs-CRP、RF。采用ELISA法测定血清抗CCP。采用血细胞自动分析仪以魏氏法检测ESR。按照相应试剂盒说明书进行操作，每个样品均设置3个重复，取平均值。进行疾病病情评分(DAS28)，DAS28分值范围为0～10分，分值越高表明疾病活动度越高。

1.5 指关节炎症相关指标检测 采用彩色多普勒超声检查，以血成像和能量图观察血供情况。患者仰卧位，双手分开置于检测台上，检测双手掌指关节、近端指间关节，每个侧面均进行纵切面和横切面扫查，在垂直骨面最厚的地方测量滑膜组织厚度。滑膜厚度<2 mm为正常，2～5 mm为轻度增生，5～9 mm为中度增生，>9 mm为重度增生。滑膜组织无血流信号为0级，1～2个点状血流信号为1级，有1～3条小血管为2级，4条以上且呈网状分布的血管为3级。同时随机选取滑膜内的动脉采用彩色血流进行脉冲多普勒取样，当滑膜内动脉的血流频谱显示清楚后测量血流的收缩期峰值流速(Vmax)，舒张末期流速(Vmin)，记录并自动计算滑膜动脉RI值。RI=(Vmax-Vmin)/Vmax，可多次取样，均测量2次取平均值。

2 结果

2.1 三组外周血PBMC中miR-21表达比较 活动期组、缓解期组、对照组外周血PBMC中miR-21相对表达量分别为0.26±0.03、0.52±0.06、1.31±0.22，活动期组低于缓解期组，缓解期组低于对照组，两两相比，P均<0.05。

2.2 三组疾病活动度相关指标及指关节炎症相关指标比较 活动期组血清hs-CRP、RF、抗CCP、ESR、DAS28评分、滑膜厚度、滑膜血流分级、滑膜动脉RI高于缓解期组(P均<0.05)，且缓解期组各指标均高于对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 三组疾病活动度相关指标及指关节炎症相关指标比较

注：与对照组相比，*P<0.05；与缓解期组相比，△P<0.05。

2.3 miR-21表达与RA活动期患者疾病活动度指标、指关节炎症指标的相关性 RA活动期患者外周血PBMC中miR-21与血清hs-CRP、RF、ESR水平及DAS28评分、滑膜厚度呈负相关(r分别为-0.621、-0.639、-0.657、-0.515、-0.559，P均<0.05)，与抗CCP水平、滑膜血流分级、滑膜动脉RI无显著相关性(r分别为-0.251、0.137、0.125，P均>0.05)。

2.4 miR-21对RA活动期的诊断价值 miR-21截断值为0.93，诊断RA活动期的ROC曲线下面积(AUC)为0.907，敏感度为91.94%，特异度为88.10%，约登指数为0.800。

3 讨论

RA病变关节腔聚集大量淋巴细胞和巨噬细胞，引起关节滑膜、周围结缔组织异常增生，大量新生血管和炎细胞浸润[6]。RA以慢性、侵蚀性关节滑膜炎为特征，进而侵犯关节软骨，韧带、肌腱、软骨下骨等，导致骨、关节软骨、关节囊破坏，造成关节畸形及功能丧失，严重影响患者生活质量[7]。RA发病机制复杂，多种细胞因子参与RA的发生发展[8]。

miRNA是机体免疫反应的重要调节因子，可调控多种细胞因子表达，参与多种炎症性疾病[9]。近年来研究表明miRNA调控人类约1/3的基因，在维持免疫功能、调控免疫系统等方面发挥重要作用[10]。异常表达的miRNA可能与肿瘤、慢性炎症、自身免疫性疾病的发病相关。miR-21的编码基因位于液泡膜蛋白基因的编码区，具有抑制多种细胞凋亡的作用[11]。在结直肠癌中，miR-21通过抑制PDCD4的表达，增强肿瘤细胞浸润，抑制细胞凋亡[12]。在哮喘中，miR-21调控炎症因子的表达，在气道重塑中发挥重要作用[13]。Dong等[14]报道，RA患者miR-21表达异常降低与Th17/Treg失衡相关。本研究结果显示，RA活动期患者外周血PBMC中miR-21表达降低，且低于缓解期患者，提示miR-21与RA发病及疾病活动度存在密切联系。

hs-CRP在机体发生炎症或组织损伤时水平显著升高，可反映炎症严重程度[15]。RF为RA敏感性标志物，但特异性稍差[16]。抗CCP特异性高于RF，因此抗CCP与RF联合诊断RA有助于降低误诊率。研究报道，抗CCP阳性患者发生侵蚀性关节炎的风险高于阴性患者，其不仅可作为RA早期临床诊断指标，还可作为RA患者骨关节破坏的预测指标[17]。ESR是评价RA活动期的重要指标之一。炎症活动期时炎症因子水平增加，红细胞易发生聚集，ESR水平因此升高[18]。RA活动期超声检查表现为低回声，这与患病关节滑膜异常增生有关[19]。滑膜增生引起血流灌注增多及血管过度增生，而滑膜内血流信号异常是RA的特征性变化[20]。RI是反映舒张期血流的指标，可作为评估RA病情的重要指标。

本研究结果显示，RA活动期患者血清hs-CRP、RF、抗CCP、ESR及DAS28评分、滑膜厚度、滑膜血流分级、滑膜动脉RI显著高于缓解期患者，且缓解期患者各指标均显著高于对照组，表明血清hs-CRP、RF、抗CCP、ESR、DAS28评分可用于RA的早期诊断和活动度评估，且超声检查对临床诊断RA及疾病活动度评估也有一定价值。相关性分析结果显示，miR-21与RA活动期患者hs-CRP、RF、ESR、DAS28评分、滑膜厚度呈负相关，表明外周血PBMC中miR-21水平有助于反映RA疾病活动度。ROC曲线分析显示，miR-21截断值为0.93时诊断RA活动期的敏感度和特异度均较高，提示检测外周血PBMC中的miR-21有助于RA的早期诊断及活动度评估。

综上所述，RA患者外周血PBMC中miR-21表达显著降低，且与多种疾病活动度指标呈负相关，miR-21检测有助于RA的诊断及疾病活动度评估。