五味子乙素对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞衰老的影响及机制

仲维莉，邹国良，徐洪涛

(1黑龙江中医药大学，哈尔滨150040；2黑龙江中医药大学附属第一医院)

高血糖症是动脉粥样硬化发生发展的主要因素之一，糖尿病患者发生大血管并发症是非糖尿病人群的2～4倍。高血糖导致的氧化应激增强是糖尿病大血管病变的发病基础。高糖还可加速内皮细胞衰老，而衰老所导致的血管内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化早期的关键环节[1]。五味子乙素为中药北五味子主要有效成分之一，部分研究表明五味子乙素具有抗氧化应激、降糖、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用。本课题组曾构建急性高糖诱导的内皮细胞衰老模型，观察到随着糖浓度增加及作用时间延长，内皮细胞呈现显著衰老特征，而L-精氨酸可以延缓高糖诱导的内皮细胞衰老，该作用与上调PI3K/Akt通路、增强端粒酶活性、修复氧化应激损伤有关；同时亦可促使内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白磷酸化，减轻活性氧簇(ROS)造成的氧化应激损伤，进而达到抗细胞衰老的作用。基于以上研究基础，2014年6月～2017年12月，本研究观察了不同浓度五味子乙素对高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抗衰老作用，并探讨抗衰老作用是否与增强细胞抗氧化应激能力有关，为防治糖尿病大血管病变中药单体的研发提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要实验材料 HUVEC(C-003-5C)第3～4代，培养液含有100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10%胎牛血清的DMEM，于培养条件为5% CO2、37 ℃的细胞孵育箱中培养。每24～48 h换培养液1次，以保证细胞具有良好的生长状态。DMEM培养基(高糖)，胰蛋白酶，胎牛血清，D-葡萄糖，碘化丙啶(PI)，细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA β-gal)染色试剂盒，ROS检测试剂盒，总一氧化氮(NO)检测试剂盒。CO2培养箱，倒置相差荧光显微镜，酶联免疫检测仪，全自动流式细胞仪，低温离心机。

1.2 细胞分组及给药方法 用0.25%胰蛋白酶消化HUVEC，待细胞生长至对数生长期(即80%融合时)进行传代。将HUVEC分为6个组。正常组给予5.5 mmol/L D-葡萄糖；高糖组给予25 mmol/L D-葡萄糖；五味子乙素1组给予25 mmol/L D-葡萄糖和5 μmol/L五味子乙素；五味子乙素2组给予25 mmol/L D-葡萄糖和10 μmol/L五味子乙素；五味子乙素3组给予25 mmol/L D-葡萄糖和15 μmol/L五味子乙素；五味子乙素4组给予25 mmol/L D-葡萄糖和20 μmol/L五味子乙素。各组细胞传代20代后进行后续检测。

1.3 细胞衰老评估 采用衰老相关的SA β-gal染色法评估细胞衰老情况，按试剂盒说明书操作，以SA β-gal染色阳性细胞(即衰老细胞)数占细胞总数的百分比表示细胞衰老情况。

1.4 细胞周期检测 取各组细胞，采用PI法流式细胞仪分析各组细胞周期。

1.5 细胞内ROS检测 取各组细胞，采用ROS检测试剂盒检测细胞内的ROS水平。

1.6 细胞内总NO检测 取各组细胞,采用Griess reagent法测算细胞内NO水平。

2 结果

2.1 各组衰老细胞百分比比较 正常组、高糖组、五味子乙素1组、五味子乙素2组、五味子乙素3组、五味子乙素4组衰老细胞百分比分别为4.18%±0.27%、5.76%±0.31%、5.28%±0.39%、4.98%±0.20%、4.87%±0.37%、4.36%±0.34%。高糖组、五味子乙素1组、五味子乙素2组、五味子乙素3组衰老细胞百分比高于正常组；五味子乙素各组衰老细胞百分比低于高糖组；五味子乙素不同浓度组间差异均有统计学意义(P均<0.01)。

2.2 各组细胞周期比较 高糖组、五味子乙素1组、五味子乙素2组、五味子乙素3组G0/G1期细胞比例高于正常组，S期细胞比例低于正常组；五味子乙素各组G0/G1期细胞比例低于高糖组，S期细胞比例高于高糖组；五味子乙素不同浓度组间差异均有统计学意义(P均<0.01)。详见表1。

表1 各组细胞周期分布比较

注：与正常组比较,﹡P<0.01；与高糖组比较，﹟P<0.01。

2.3 各组细胞中ROS水平比较 正常组、高糖组、五味子乙素1组、五味子乙素2组、五味子乙素3组、五味子乙素4组细胞中ROS水平分别为251.63±15.04、495.82±10.39、421.71±9.09、363.06±17.88、292.67±12.27、264.74±14.38。高糖组、五味子乙素1组、五味子乙素2组、五味子乙素3组ROS水平高于正常组；五味子乙素各组ROS水平低于高糖组；五味子乙素不同浓度组间差异均有统计学意义(P均<0.01)。

2.4 各组细胞中NO水平比较 正常组、高糖组、五味子乙素1组、五味子乙素2组、五味子乙素3组、五味子乙素4组细胞中NO水平分别为(24.05±1.61)、(5.90±0.89)、(8.13±0.82)、(13.15±1.46)、(14.7±1.35)、(17.83±1.14)μmol/L。高糖组、五味子乙素1组、五味子乙素2组、五味子乙素3组NO水平低于正常组；五味子乙素各组NO水平高于高糖组；五味子乙素不同浓度组间差异均有统计学意义(P均<0.01)。

3 讨论

糖尿病大血管病变是2型糖尿病致残、致死的主要原因。关于糖尿病大血管病变的防治目前仍处于控制相关危险因素的阶段，缺乏特异性的药物延缓其发生发展。近年来研究显示，内皮细胞功能障碍是糖尿病患者发生大血管病变的始动环节，而内皮细胞衰老是内皮完整性缺失进而发生血管并发症的关键因素，因此，延缓内皮细胞衰老将成为防治糖尿病大血管病变的新靶点。

关于细胞衰老的机制至今尚未完全明确，但目前公认的是端粒-端粒酶学说及氧化应激学说。细胞衰老是指年龄相关的细胞固有功能丧失，分为复制性衰老及非复制性衰老。目前复制性衰老研究较多，主要由于细胞有丝分裂中复制或增殖压力导致的DNA损伤反应等复制障碍，引起细胞周期阻滞，其特殊形式是应激引起的早衰老。糖尿病大血管病变即属于高糖致氧化应激损伤导致的血管内皮细胞的早衰老。许多证据表明，细胞核内端粒结构和功能与衰老密切相关，随着细胞分裂周期性、渐进性损耗，最终引起细胞复制性衰老，而不单纯依赖于端粒的长度[2～4]。端粒酶是在细胞中负责延长端粒的一种酶，是一种核糖核蛋白，以自身RNA模板合成端粒DNA，为细胞持续分裂提供遗传基础。一些研究表明，端粒酶可通过维持端粒长度、结构及功能来延缓细胞衰老[5,6]。高糖致氧化应激损伤促进内皮细胞功能障碍是细胞衰老的主要原因之一[7]。Unterluggauer等[8]及本课题组前期研究[9]均报道,HUVEC衰老后，细胞周期分布特点是随着葡萄糖浓度增加，G0/G1期的HUVEC比例逐渐增加，而S期HUVEC比例逐渐减少，糖浓度对细胞周期的影响具有时间依赖性，这表明细胞增殖能力随着葡萄糖浓度的升高而下降，进一步证实高糖加速了HUVEC衰老的进程。

氧化应激损伤增强与NO生物利用度下降在内皮细胞衰老中起着至关重要的作用[10，11]。NO与过量ROS反应而减轻细胞氧化应激损伤的程度。NO具有抗凋亡、抑制平滑肌细胞增殖、抗血小板聚集、抗白细胞黏附及调节血管管腔大小等多种作用，在抗动脉粥样硬化过程中发挥十分重要的作用[12～14]。本研究结果显示，HUVEC传代20代后正常组细胞仍维持较好的细胞增殖状态，SA β-gal染色阳性细胞比例<5%;而高糖组细胞周期阻滞在G0/G1期，SA β-gal染色阳性细胞比例增多，ROS水平升高，NO水平明显下降。这说明长期慢性高糖刺激后细胞氧化应激损伤加重，不仅使NO功能下降，同时可能使端粒酶活性下降、无法修复因应激损伤，导致端粒缩短，进而发生内皮细胞过早衰老。

五味子乙素为北五味子的主要有效成分之一，具有多种药理作用，其中抗氧化应激损伤是其非常重要的药理作用。生物体中的自由基主要是氧自由基(如超氧阴离子自由基、羟自由基)。过多的氧自由基在体内大量堆积可引起细胞毒性作用，造成蛋白、脂质、DNA等生物大分子损伤，从而引起多种疾病[15]，如心脏病、阿尔茨海默病、帕金森病和肿瘤。研究显示，五味子乙素可通过直接清除氧自由基[16]、提高抗氧化酶活性[17]、提高体内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)的含量[18]、降低MDA和LDH水平[19]、减少ROS的产生[20]而发挥抗氧化作用。本研究采用四种不同浓度的五味子乙素作用于高糖诱导的HUVEC，结果显示5～20 μmol/L的五味子乙素呈剂量依赖性延缓HUVEC衰老，表现为SA β-gal染色阳性细胞比例降低，G0/G1期细胞比例减少，细胞内ROS水平降低，NO水平增高，尤其是20 μmol/L的五味子乙素抗衰老作用最为明显。在后续实验中我们将进一步增加五味子乙素的剂量，以筛选抗衰老作用最佳的药物浓度，筛选适合长期补充、发挥抗内皮细胞衰老作用的有效剂量，以延缓糖尿病并发症的发生发展。

综上所述，五味子乙素可延缓高糖诱导的HUVEC衰老进程，作用呈剂量依赖性。这种抗衰老作用可能与减轻氧化应激损伤、增加NO生物利用度、增强端粒酶活性进而修复端粒的作用有关。我们推测五味子乙素通过调节NO的合成，减少ROS的产生，减轻氧化应激损伤，延缓因氧化应激而加速的细胞复制性衰老进程；而氧化应激损伤减轻则可增强端粒酶的活性，发挥其延长端粒长度及修复端粒功能的作用，进而延长细胞的寿命，保持细胞增殖潜能，延缓细胞衰老进程。我们将在后续研究中进一步探讨五味子乙素是否可通过调节PI3K/Akt通路、调节端粒酶活性及减轻氧化应激损伤而达到抗HUVEC衰老的作用。