东莞地区非家族性低钾型周期性麻痹患者外周血KCNJ18基因突变情况分析

杨媚，罗成宏，付伦姣，廖成钜

(东莞市第三人民医院，广东东莞523326)

低钾型周期性麻痹(HOKPP)是一种罕见的常染色体显性遗传性骨骼肌通道病，发作时伴有低钾血症，严重者可危及生命[1]。HOKPP患者多为青少年和年轻人(2～30岁)，可分为家族性和非家族性，二者症状相似，但后者不具有家族聚集性。非家族性HOKPP包括无家族发作史的甲亢性低钾型周期性麻痹(TPP)、散发性周期性麻痹(SPP)[2]，其发病机制尚不明确。离子通道基因KCNJ18是编码骨骼肌特异性内向整流K+(Kir)通道蛋白，既往研究显示，中国山东地区人群KCNJ18与HOKPP的发病相关[2]。在非家族性HOKPP中，研究者对美国、巴西、法国、泰国和新加坡地区TPP患者血液样本检测，发现KCNJ18突变与TPP易感性和SPP的发病有关[3，4]。但中国人群KCNJ18与非家族性HOKPP的相关性尚不明确[5,6]。为此，本研究对东莞地区非家族性男性HOKPP患者的外周血样本进行PCR扩增和Sanger测序，分析KCNJ18的突变情况。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2017～2018年东莞市第三人民医院收治的48例非家族性男性HOKPP患者(HOKPP组)，年龄18～68(36.15±2.82)岁。诊断标准：①急性肌无力(不能行走)；②发作时血清K+<3.5 mmol/L；③排除家族性HOKPP及利尿剂、泻药、激素等药物引起的低钾血症。血清K+基础状态为(4.07±0.05)mmol/L、发作期为(2.60±0.07)mmol/L，促甲状腺激素(TSH)为(0.84±0.15)mIU/L，游离三碘甲腺原氨酸(FT3)为(9.88±1.50)pmol/L，游离甲状腺激素(FT4)为(30.29±3.37)pmol/L。另选择男性健康体检者30例作为对照组，排除甲状腺功能亢进或HOKPP家族史。年龄20～62(36.43±2.12)岁，血清K+(4.00±0.06)mmol/L，TSH(1.44±0.17)mIU/L，FT3(4.77±0.15)pmol/L，FT4(16.95±0.36)pmol/L。两组年龄、基础状态血清K+比较差异无统计学意义(P均>0.05)，HOKPP组TSH低于对照组而FT3、FT4高于对照组(P均<0.05)。本研究经医院伦理委员会审核通过，受试者均知情同意。

1.2 外周血KCNJ18基因突变检测方法

1.2.1 DNA提取 采集受试者外周血3 mL。按照AxyPrep血液基因组DNA小剂量制备试剂盒AxyPrep-96 DNA Extraction Kit(AxyPrep，美国)进行DNA提取。采用紫外分光光度计(DU-70，Beckman，美国)检测DNA提取质量。

1.2.2 KCNJ18基因片段扩增与测序 采用PCR法进行基因片段扩增。使用软件设计KCNJ18(GenBank：NG_042809.1)引物，上游：5′-ATGCTGTCCTCTCTGTTCC-3′，下游：5′-TGGCCGGGGAGAGGCCC-3′，目标产物长度1.4 kb。PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性30 s；65 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，共28个循环；72 ℃延伸3 min。4 ℃保温。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后使用PCR产物纯化试剂盒AmpureXP(Beckman，美国)回收。将PCR产物送至上海生工公司，采用Sanger法进行双向测序(3130DNA测序仪，Life Technologies，美国)，测序扩增采用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit试剂盒(Life Technologies，美国)。PCR产物测序结果使用Mutation Surveyor软件进行突变位点分析(参考序列为NG_033093.1)。

2 结果

2.1 HOKPP组KCNJ18基因变异情况 HOKPP组共检出5个新的KCNJ18突变位点，分别为G116A、G119A、C167A、A745G和G576C。5个位点均为错义突变，分别导致R(精氨酸)突变为Q(谷氨酰胺)，R(精氨酸)突变为H(组氨酸)，A(丙氨酸)突变为E(谷氨酸)，Q(谷氨酰胺)突变为H(组氨酸)，I(异亮氨酸)突变为V(缬氨酸)。KCNJ18突变位点的Sanger测序鉴定见图1。

注：箭头所示为突变位点。

2.2 两组KCNJ18基因5个位点的纯合突变和杂合突变情况比较 比较G116A、G119A、C167A、A745G、G576C位点在HOKPP组和对照组中的频率分布差异及氨基酸序列改变，结果显示，5个位点纯合突变在两组中均有分布。对照组G116A、G119A、C167A、A745G的纯合突变率均为100%，杂合突变均为0；HOKPP组G116A、G119A、C167A、A745G纯合突变率均为66.7%，杂合突变率为33.3%。HOKPP组G116A、G119A、C167A、A745G杂合突变率高于对照组(P均<0.05)。

3 讨论

目前认为，HOKPP的发生主要由遗传因素引起。HOKPP可分为家族性和非家族性HOKPP，非家族性HOKPP包括无家族发作史的TPP和SPP，其中TPP继发于高甲状腺素血症，是甲亢患者常见的并发症。家族性和非家族性HOKPP拥有相似的表型[7]，提示二者可能存在相似的致病机制。研究证实，家族性HOKPP患者存在离子通道缺陷[8]。Ryan等[4]研究认为，TPP患者离子通道基因KCNJ18突变与TPP相关，提示KCNJ18基因突变可能与HOKPP相关。

在KCNJ18突变的相关研究中，TPP的KCNJ18突变报道较多。Li等[9]报道了TPP患者的3个新KCNJ18突变位点，并提出KCNJ18基因在中国大陆TPP患者中的突变携带率约为3.1%。Zheng等[3]报道，TPP患者中存在KCNJ18基因c.505G>C突变，该位点变异可导致G169R甘氨酸到精氨酸的错义突变，从而导致细胞内外电流下降。Cheng等[10]报道，TPP患者KCNJ18的G502A突变可引起缬氨酸到甲硫氨酸的错义突变。而SPP的KCNJ18突变情况目前报道较少。梅志忠等[5]报道，SPP患者中未检测到KCNJ18突变位点。Cheng等[10]发现，SPP患者中的KCNJ18杂合突变可导致R43C和A200P氨基酸替换。本研究收集了东莞地区48例非家族性男性HOKPP患者的外周血样本进行DNA测序，新发现4个KCNJ18突变位点。经查阅文献，这4个位点均未收录在人类基因突变及相关疾病数据库中，为本研究首次报道。

本研究结果显示，G116A、G119A、C167A和A745G的纯合突变在HOKPP组和对照组中均有出现，提示这些纯合突变可能为非致病性的多态性位点。同时，在对照组中未发现这4个位点的杂合突变，且位点的杂合突变与非家族性HOKPP相关，提示G116A、G119A、C167A和A745G杂合突变可能为致病性突变。目前KCNJ18突变的功能影响仍不清楚。Li等[9]报道，与无KCNJ18突变的TPP患者比较，KCNJ18突变患者肌肉无力的持续时间更短，肌肉酸痛或肢体麻木的症状更普遍，肌肉无力的复发率更高。KCNJ18基因G169R变异可导致人肾上皮细胞系293细胞内向和外向电流密度异常降低[3]。此外，KCNJ18基因G502A突变被发现可影响K+内流和外流[10]。因此，我们推测，KCNJ18位点的突变有可能与调节K+的内流和外流有关，具体的功能有待后续基于细胞和动物水平的KCNJ18位点突变的功能研究提供更多的证据。

对比不同地域非家族性HOKPP患者KCNJ18位点突变的情况，我们发现梅志忠等[5]检测的广东地区散发性HOKPP患者以及刘晓黎等[6]报道的上海地区汉族人群TPP患者中均未发现KCNJ18致病性相关突变位点。而Ryan等报道的美国、巴西、法国地区30例TPP患者中有5例存在KCNJ18突变，27例新加坡TPP患者中有7例，31例泰国TPP患者中没有KCNJ18突变，83例中国香港患者中仅1例KCNJ18突变。提示非家族性HOKPP患者的KCNJ18突变频率存在地区差异，欧美地区TPP患者KCNJ18突变率相对较高。而泰国、中国香港TPP患者几乎未检测到突变，可能与受试者样本量较小有关。

综上所述，我们在东莞地区非家族性男性HOKPP患者中新发现了KCNJ18的G116A、G119A、C167A、A745G、G576C错义突变位点，其中G116A、G119A、C167A和A745G与非家族性HOKPP有关。未来KCNJ18位点突变的功能研究将进一步提供KCNJ18参与HOKPP疾病发生的证据。