超声波辅助酶法提取沙棘果油及其体外抗氧化能力分析

刘 俭 蔡永国 张 兵 欧阳韶 杨海燕，3

(新疆农业大学食品科学与药学学院1，乌鲁木齐 830052) (新疆慧华沙棘生物科技有限公司2，阿勒泰 836200) (新疆沙棘工程技术研究中心3，乌鲁木齐 830000)

沙棘(HippopherhamnoidsL.)为胡颓子科沙棘属灌木，又名醋柳、黑刺等[1]，广泛分布于欧亚的温带地区[2]。我国沙棘资源丰富，总面积达3000万亩[3]，占世界沙棘总面积的95%，且以肋果沙棘和中国沙棘亚种分布居多[4]。沙棘鲜果富含多糖、蛋白质、氨基酸、维生素、黄酮类化合物及不饱和脂肪酸等[5]，沙棘果油(本研究仅指鲜果果油)是沙棘果实天然生物活性成分的精华，具有抗辐射、抗衰老、抗溃疡、降血脂和增强免疫力等药理功效[6]，被广泛应用于医药、食品和化妆品等领域[7]。

目前直接从沙棘鲜果中提取沙棘果油的方法主要有酶法[8]、压榨离心法[9]和有机溶剂萃取法[10]等。与传统提油工艺相比，酶法提油条件温和，能够最大限度保留活性成分，且其所需设备简单，满足食用油脂生产“安全、高效、营养、绿色”的原则[11]。UAE提取技术在近年来发展迅速，张妍[12]等提取菜籽油，发现UAE提取油脂得率可达67.55%，明显优于单一酶法提取。超声波在液体中可以产生机械效应、空化作用以及热效应等[13]，破坏细胞壁，进而暴露更多的酶促位点[14]，与酶法结合进行酶解反应，能够极大地缩短酶法提取时间和提高产品得率。有关UAE提油的研究较多，张伟光[15]等采用超声波辅助蛋白酶法提取冬瓜籽油，在最优条件下冬瓜籽油的提取率可达82.55%，比优化前高10.06%；徐君飞等[16]从茶叶籽中提油，发现UAE提取工艺在最佳条件下，茶叶籽出油率为(52.61±0.11)%。

顾晶晶[17]采用超声波预处理沙棘原浆，超声功率200 W、超声时间10 min，然后加入酶制剂进行酶解提油，发现超声波预处理对酶法提取沙棘果油没有帮助。然而关于UAE提取沙棘果油鲜有报道，本研究基于此出发点以沙棘鲜果为原料，采用UAE提取沙棘果油。首先在单因素试验的基础上，通过响应面优化复合酶制剂的比例，然后利用单因素与正交试验对沙棘果油的提取工艺进行优化，旨在降低沙棘果油的提取成本和提高果油得率；同时运用GC对沙棘果油的脂肪酸组成进行分析，并测定沙棘果油的体外抗氧化能力，以期为UAE提取高品质的沙棘果油的工业化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

沙棘鲜果：2017年10月采摘于新疆青河县，-18 ℃低温冻存至6月份实验；果胶酶：最适pH 3.5～4.0，最适温度50 ℃，酶活力500 U/mg；纤维素酶：pH 4.8～5.0，50 ℃，酶活力≥50 U/mg；酸性蛋白酶：pH 2.5～4.0，40～50 ℃，酶活力≥50 U/mg。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器与设备

TC-1056破壁养生调理专家；TDL-5-A低速大容量离心机；5417R小型台式冷冻型离心机；KQ-250DE数控超声波清洗器；SZF-06A脂肪测定仪；GC-2014气相色谱仪；UV-1200紫外可见分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 沙棘果油提取工艺流程

沙棘冻果→解冻(水温60 ℃、时间1 min)→打浆过滤→沙棘原浆→调节pH→超声酶解→离心分离(4 000 r/min离心20 min)→上层果油粗品→二次离心(8 000 r/min离心10 min )→沙棘果油

1.2.2 沙棘原浆基本指标的测定

水分的测定：GB 5009.3—2016直接干燥法；可溶性固形物：使用PAL-1数字手持袖珍折射仪进行测定，结果以°Brix计；pH：使用PHS-3C PH计进行测定；粗脂肪的测定：GB 5009.6—2016索氏抽提法；粗蛋白的测定：GB 5009.5—2016凯氏定氮法；总酸：GB/T 12456—2008酸碱滴定法，结果以苹果酸计(沙棘原浆主要的有机酸之一[18])。

1.2.3 沙棘果油得油率计算

沙棘果油得油率和提取率的计算公式：

(1)

式中：m为果油质量/g；M为沙棘原浆的质量/g。

(2)

式中:W为沙棘原浆粗脂肪含量。

1.2.4 复合酶制剂比例的筛选

1.2.4.1 单一酶添加量的单因素试验

选择果胶酶、纤维素酶、酸性蛋白酶添加量进行单因素试验，固定酶解时间4 h、超声功率150 W，考察三种酶在其最适酶解环境下，添加量梯度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)%对沙棘果油得油率的影响。

1.2.4.2 复合酶制剂比例的优化试验

根据单因素试验的结果，设置酶解的条件为：超声功率150 W、酶解时间4 h、酶解温度50 ℃和pH 4.0。选取果胶酶添加量(A)，纤维素酶添加量(B)，酸性蛋白酶添加量(C)作为试验因素，以沙棘果油得油率(Y)为响应值，采用Design-Expert 10.0.3软件，根据Box-Behnken试验设计原理，优化复合酶制剂比例，试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验的因素与水平

1.2.5 提取工艺的优化

1.2.5.1 单因素试验

采用单因素试验，考察不同的超声功率(100、125、150、175、200)W、超声酶解时间(2、3、4、5、6)h、pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)和复合酶总添加量(0.6、0.9、1.2、1.5、1.8)%对沙棘果油得油率的影响。

1.2.5.2 正交优化试验

在单因素试验的基础上，选取超声功率、超声酶解时间、pH和复合酶总添加量一共4个因素，按照L9(34)的正交表进行正交试验。探究UAE提取沙棘果油工艺优化的参数。

表2 正交试验的因素与水平

1.2.6 GC分析沙棘果油脂肪酸组成

根据GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》中第三法归一化法进行测定[19]。

1.2.7 沙棘果油活性成分的测定

黄酮：参照Sharif等[20]方法进行测定；维生素E：参照Cenkowski等[21]的方法进行测定；类胡萝卜素：参照杨万政等[22]的方法进行测定。

1.2.8 沙棘果油体外抗氧化能力的测定

·OH清除能力的测定：参照Hifney等[23]的方法进行测定。ABTS+·清除能力的测定：参照Li等[24]的方法进行测定。

1.3 数据分析

数据处理和统计分析使用Excel和SPSS 21.0软件，作图采用Origin 8.5软件，使用Design-Expert 10.0.3软件进行Box-Behnken响应面分析和Taguchi OA试验设计。

2 结果与分

2.1 沙棘原浆的主要成分

对制得的沙棘原浆立即进行理化指标的测定，其测定结果见表3。

表3 沙棘原浆的主要成分

2.2 复合酶制剂比例的确定

2.2.1 单一酶添加量的单因素试验结果

图1 单一酶添加量对沙棘果油得油率的影响

2.2.2 复合酶制剂比例的优化试验结果

基于单因素试验，利用响应面分析法优化复合酶制剂的比例，进行三因素三水平的响应面试验。具体试验设计及结果见表4。

表4 Box-Behnken试验设计及结果

表5 Box-Behnken试验结果二次回归方差分析

注：P<0.01，极显著(**)；P<0.05，显著(*)。

2.3 UAE提取工艺的优化

2.3.1 单因素试验结果

图2 不同因素对沙棘果油得油率的影响

由图2可知，在酶法提取沙棘果油的过程中施加超声波，当超声功率为100～125 W时，得油率不断升高，在超声功率125 W时达到最高。这是因为超声波的机械振动和空化作用能够破坏细胞组织，促进胞内物质的释放，酶解与之结合能够大大提高果油得率[27]。当超声功率大于125 W时，沙棘果油得率开始下降；当超声功率在200 W时，甚至低于对照组(0 W)，这与较高的超声功率导致酶活降低或部分丧失有关[28]。随着超声酶解时间的延长，沙棘果油得率不断提高，在超声酶解时间2～3 h时，得油率上升幅度较大，当时间超过3 h后，得油率基本保持不变。这是由于酶解效率随着时间的延长逐渐提高，油脂释放就会越多，但是继续延长时间，酶解反应会因为底物减少以及产物增多而受到抑制。随着pH升高，沙棘果油得油率先增加后减小，当pH为3.5时，得油率最高为3.424%。这是因为酶不在最适pH条件下，其活性会受到抑制，导致得油率下降。当复合酶总添加量为0.6～1.2%时，沙棘果油得率随着酶添加量的增多不断升高，继续增加复合酶总添加量，得油率变化不大。

2.3.2 工艺的优化试验结果

由表6可知，正交试验结果最优组合为2号(X1-1X2-2X3-2X4-2)，得油率为3.465%，各因素对沙棘果油得油率的影响主次顺序为X4(复合酶添加量)>X1(超声功率)>X3(pH)>X2(超声酶解时间)，最优工艺的水平组合为X1-2X2-2X3-2X4-2。对其进行验证试验，沙棘果油得油率为(3.494±0.025)%，优于正交试验2号。因此选择X1-2X2-2X3-2X4-2作为UAE提取沙棘果油的最佳工艺，即超声功率125 W、超声酶解时间3 h、pH 3.5和复合酶添加量1.2%，超声酶解温度50 ℃，在此工艺下的沙棘果油得油率为(3.494±0.025)%，提取率为83.9%。

表6 正交试验结果

2.4 沙棘果油的脂肪酸组成及其活性成分分析

2.4.1 脂肪酸组成分析

据查国立北平师范大学始建于1902年京师大学堂(师范馆)，后经多次大学演变于1931年7月北平师范大学与北平女子师范大学合并，定名国立北平师范大学。1932年经教育部正式批准改为国立北平师范大学。1937年7月，卢沟桥事变后，北平师范大学迁往西安，与国立北平大学、国立北洋工学院组成西安临时大学。1938年春，西安临时大学迁至汉中，改名为国立西北联合大学，北平师大改为西北联大教育学院。同年8月，西北联合大学教育学院改为师范学院，后改称国立西北师范学院。

采用GC分析UAE提取的沙棘果油脂肪酸组成，由表7可知，沙棘果油的脂肪酸被检测出13种，主要脂肪酸为棕榈酸、棕榈油酸和亚油酸。不饱和脂肪酸共有6种，含量高达60.596 1%，分别为棕榈油酸、顺-10-十七碳一烯酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸和神经酸，其中棕榈油酸含量达到43.389 9%，亚油酸含量为11.266 5%。棕榈油酸具有降低血脂，预防动脉硬化和缓解糖尿病、脂肪肝等慢性疾病的功效[29]；亚油酸是人体必需脂肪酸，具有增强机体免疫能力，防治动脉粥样硬化和老年性肥胖症等功效[30]，由此可知沙棘果油具有极高的营养价值和经济价值。

表7 沙棘果油的脂肪酸组成与相对含量

2.4.2 活性成分分析

表8可见，采用UAE提取的沙棘果油含大量活性成分，其黄酮含量为(62.88±0.26) mg/100 g，维生素E含量为(150.35±0.08) mg/100 g，类胡萝卜素含量为(14.66±0.32) mg/100 g。

表8 沙棘果油的活性成分

2.5 沙棘果油体外抗氧化能力研究

2.5.1 沙棘果油清除·OH能力

图3 对·OH的清除率

羟自由基广泛存在于生物体内，是一种细胞毒性很强的自由基，能使胞内的蛋白质、核酸等物质出现损伤，从而引发各种疾病和机体衰老，且其反应极快[31]。由图3可知，随着质量浓度的增大，沙棘果油和VC清除·OH的能力几乎呈线性上升，其清除·OH的IC50分别为179.33 μg/mL和122.62 μg/mL，VC的·OH清除能力是沙棘果油的1.46倍。结果表明，沙棘果油清除·OH的能力较强，略弱于VC。

2.5.2 沙棘果油清除ABTS+·能力

由图4可知，在质量浓度为4～12 mg/mL时，沙棘果油的ABTS+·清除能力呈现线性上升的趋势，由41.26%～95.25%，之后趋于平缓。VC对ABTS+·的清除能力基本维持在99%左右，表明质量浓度为12 mg/mL的沙棘果油与VC的ABTS+·清除能力相近。沙棘果油对ABTS+·清除作用的IC50=5.54 mg/mL。

图4 对ABTS+·的清除率

3 讨论

通过测定UAE提取的沙棘果油脂肪酸组成、活性成分及其体外抗氧化能力，结果证明沙棘果油富含不饱和脂肪酸，是一种营养价值极高的植物油脂，同时具有较强的抗氧化能力。目前直接从沙棘鲜果中提取沙棘果油的方法主要有酶法、压榨离心法和有机溶剂萃取法等。李炜等[9]采用压榨离心法提取沙棘果油，温度60 ℃、8 000 r/min离心10 min，工艺简单但是得油率不足1%，提取率为35.6%。采用UAE提取沙棘果油，超声功率125 W、超声酶解时间3 h、pH 3.5和复合酶添加量1.2%，超声酶解温度50 ℃，在该条件下的沙棘果油得油率可达3.5%，提取率为83.9%。沙棘果实的细胞壁主要由果胶、纤维素和半纤维素等物质组成[32]，沙棘果油在果实两端和细胞质的网络结构中，以脂蛋白、脂多糖等形式存在[33]。选择果胶酶、纤维素酶和酸性蛋白酶复配，能使细胞壁与胞内网络结构酶解更加彻底，提高沙棘果油的得油率。酶法提油反应条件温和，结合超声波辅助处理可以大大减少酶解时间，本实验中，超声酶解时间3 h，较康健等[32]缩短50%，较汪晓琳[34]缩短29.2%，最大限度地保持了沙棘原浆风味和保留沙棘天然活性成分。沙棘原浆经UAE提取沙棘果油后，采用液体超微化粉粹、超高压均质匀浆、脱气和杀菌灌装将果浆加工成沙棘浊汁[35]，此种方法能够增加单位原料价值，为企业经济效益的提高提供了技术支撑。

4 结论

采用单因素结合响应面试验对复合酶的比例进行优化，得到最优添加量比例为果胶酶∶纤维素酶∶酸性蛋白酶=0.675%∶0.424%∶0.508%。通过单因素与正交试验对沙棘果油的UAE提取工艺进行优化，获得最优的工艺为超声功率125 W、超声酶解时间3 h、pH 3.5和复合酶添加量1.2%，超声酶解温度50 ℃，该条件下沙棘果油得油率为(3.494±0.025)%，提取率为83.9%。运用GC对沙棘果油的脂肪酸组成进行分析，沙棘果油的脂肪酸被检测出13种，主要为棕榈酸、棕榈油酸和亚油酸。不饱和脂肪酸共有6种，含量高达60.596 1%，分别为棕榈油酸、顺-10-十七碳一烯酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸和神经酸，其中棕榈油酸含量达到43.389 9%，亚油酸含量为11.266 5%。沙棘果油的黄酮含量为(62.88±0.26)mg/100 g，维生素E含量为(150.35±0.08)mg/100 g，类胡萝卜素含量为(14.66±0.32) mg/100 g。同时，体外抗氧化能力的测定结果表明沙棘果油具有较强的体外抗氧化能力。