盐肤木果油中没食子酸的UPLC-MS及HPLC分析

郑牧垚

摘 要：盐肤木果实中没食子酸等多酚类物质是重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗病毒、消肿瘤等多种生物学活性。采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS），分别对压榨法、乙醚浸提法和超临界CO2萃取法3种提取方法所得盐肤木果油中没食子酸等多酚成分进行了定性分析，再以没食子酸标准品为对照，采用高效液相色谱法（HPLC）对各样品中没食子酸含量进行了定量分析。结果表明：3种样品中均检测到没食子酸的存在，其含量在69.5～434.4 mg/L之间，但不同样品中没食子酸含量差异显著，即提取盐肤木果油的方式不同，其油脂中含没食子酸的多少不同，其中以乙醚浸提油中样品中没食子酸最多，达（426.7±7.7）mg/L。该研究可为进一步开发利用盐肤木果油资源提供方法借鉴。

关键词：没食子酸;超高效液相色谱-质谱联用分析;高效液相色谱法;盐肤木;果油

盐肤木是漆树科盐肤木属的落叶小乔木或灌木，其在我国分布广泛，除东北、新疆和内蒙古外，其余各省区均有分布[1]。盐肤木是中国传统药用植物，其根、茎、叶、果实及五倍子均可入药，具有祛风化湿、消肿软坚、收敛解毒、生津润肺、降火化痰等功效[2]。盐肤木树上所产的五倍子主要成分为鞣酸（单宁酸）、没食子酸及绿原酸等。没食子酸，又名倍酸、3，4，5-三羟基苯甲酸，常用作抗氧化剂，具有抗炎症、抗突变、抗氧化、抗自由基等多种生物学活性[3]，在食品、生物、医药化工等领域有广泛应用[4]。盐肤木果油富含不饱和脂肪酸，其不饱和脂肪酸含量可达72%，极具开发应用价值[5-7]，作为木本油料，盐肤木果油已被批准为新资源食品（卫生部公告2013年第1号），而盐肤木果油中没食子酸等多酚类物质有无及其含量高低，是其品质高低的一项重要指标[8]。对盐肤木果实及果油中没食子酸等多酚成分及其含量的研究，可为进一步开发利用盐肤木资源提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

超临界CO2萃取装置，南通市华安超临界萃取有限公司;超高效液相色谱-质谱联用仪，安捷伦1290II，Q-TOF，含单四级杆-飞行时间质量分析器;高效液相色谱，依利特P230II含紫外检测器;超声波清洗仪，宁波新芝生物科技股份有限公司;电子天平（FA1204N），上海民桥精密科学仪器有限公司;粉碎机（DXP-20C），广州市大祥电子机械有限公司;电热恒温鼓风干燥箱（DGT-G250），合肥华德利科学器材有限公司;小型榨油机。

1.2 材料与主要试剂

盐肤木果实，采自安徽六安佛子岭，晒干后冰柜中保存;色谱纯甲醇，上海星可高纯溶剂有限公司;磷酸，AR，国陇化工股份有限公司;质谱纯甲醇，法国默克公司;甲酸，质谱纯;水，市售瓶装娃哈哈纯净水;没食子酸，标准对照品，上海原液生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 盐肤木果油的提取 （1）压榨法：将盐肤木果过筛去除杂质后，用小型榨油机压榨，得到盐肤木果压榨毛油。（2）乙醚浸提法：将盐肤木果实清洗干净，烘干至恒重，粉碎过筛，采用索氏抽提法，以无水乙醚为提脂剂，于45 ℃水浴加热回流抽提3～5 h，直至回流液无色，用玻璃棒蘸取回流液于滤纸上风干后无印记为止，充分提取盐肤木果油及其他脂溶性物质，旋转蒸发器内去除乙醚，并在鼓风干燥箱内45 ℃烘至恒重，即得盐肤木果实乙醚浸提油。（3）超临界萃取法：将盐肤木果实置60～70 ℃鼓风干燥箱中烘干，粉碎成80～100目的粉末，称取300～400 g该粉末，装入料筒后放于萃取釜中，设定超临界CO2萃取的条件分别是：萃取压力25 MPa、萃取温度40 ℃、分离压力10 MPa、分离温度50 ℃、萃取时间2 h，即每30 min收集萃取油脂1次，重复收集4次，即得超临界CO2萃取盐肤木果油。

1.3.2 分析样品的处理 由于盐肤木果油粘稠而成分复杂，如果用该油脂直接进样进行HPLC或UPLC-MS分析，其油脂成分又是多酚类成分分析的干扰杂质，油脂成分相对于多酚类物质含量又过高，因此，必须除去绝大部分油脂成分。利用多酚类物质易溶于甲醇、乙醇等醇类溶剂的特性，在测定前，用甲醇萃取出油脂中的多酚类成分。具体方法：分别准确吸取以上制备的各种盐肤木果油1 mL，加入质谱纯甲醇1 mL，充分振荡后静置24 h，吸取醇层，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得UPLC-MS分析或HPLC分析所需的樣液。因此，每mL如此处理的样品所含没食子酸的量视为等同于同体积盐肤木果油中没食子酸含量。

1.4 没食子酸的超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）分析鉴定

1.4.1 超高效液相色谱（UPLC）条件[7，9-11] Agilent Eclipse Plus C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱温30 ℃，进样量2 μL，流速0.25 mL/min，流动相A为0.1%质谱甲酸水溶液，B为质谱甲醇（表1）。

1.4.2 质谱（MS）条件 电子电离（EI），负离子模式，单四极杆-飞行时间质量分析器，分子分离器条件：干燥气（N2）流速10 L/min，温度320 ℃;鞘气：280 ℃，流速为11 L/min;雾化器喷雾压力35 psi。

1.4.3 质谱检测参数的确定 单四极杆—飞行时间质量分析器进行扫描的时候，有2个关键的检测参数，一个是一级质谱的电离电压，另一个是二级质谱的碰撞能，在最优的电离电压下样品分子会产生稳定的母离子，在最优的碰撞能下，产生的二级质谱的子离子数是最大的，因此测定不同的物质，2个参数都需要经过仪器条件的优化，然后才能在最优参数下进行定量和定性分析。经电离电压设定为145～175 V的没食子酸一级质谱质子流（M/Z=169.016）大小可见，在145 V时最大，出峰最好;由碰撞能为10～40 eV时没食子酸二级质谱图可看出，没食子酸二级质谱质子流（M/Z=125.026）在碰撞能为20 eV时最好。因此，盐肤木果油中没食子酸的最优参数优化结果是：一级质谱的电离电压为145 V，二级质谱的碰撞能为20 eV[7]。

1.5 高效液相色谱（HPLC）紫外检测含量测定

1.5.1 HPLC色谱条件[12-13] ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温25 ℃;检测波长273 nm;进样量10 μL;流动相：A为色谱甲醇，B为0.1%磷酸水溶液，流速1 mL/min（表2）。

1.5.2 没食子酸标准曲线的绘制 将没食子酸标准品用甲醇∶0.1%磷酸水=80∶20的流动相溶液稀释成梯度浓度分别是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的标准系列溶液，按上述1.5.1的HPLC色谱条件对标准系列溶液分别进行测定（图3），将测定结果以峰面积（mAU.s）为纵坐标Y、没食子酸浓度（mg/mL）为横坐标X，绘制标准曲线（图4），得到回归方程。

1.5.3 样品中没食子酸含量的测定 按照没食子酸标准溶液测定的同样条件，对各样品进行进样分析，将各样品的HPLC峰面积数值代入标准曲线的回归方程，计算出各样品中的没食子酸含量（mg/mL）（表3）。

2 结果与分析

2.1 没食子酸的液质联用分析鉴定结果

2.1.1 常见多酚类物质标准品的一级质谱及没食子酸的一、二级质谱 按上述1.4 UPLC-MS的条件，对盐肤木中常见的5种多酚类物质的标准品（没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸和漆酚）的混标溶液进行UPLC-MS分析，一级质谱总离子流色谱图可见，没食子酸的负离子模式（M/Z=169.016）一级质谱总离子流出峰时间是1.321 min，其二级质谱中碎片离子（M/Z=125.02）较稳定（图1）。

2.1.2 盐肤木果油样品中没食子酸的一级、二级质谱定性分析结果 按上述1.4UPLC-MS的条件，对3种方式提取的盐肤木果油样品进行一级、二级质谱分析的结果可见，压榨盐肤木果油样品、乙醚萃取及超临界CO2萃取盐肤木果油样品中一级质谱中总离子流出峰时间在1.32左右均有一个质荷比M/Z=169.016的较强的离子峰，其二级质谱中质荷比为M/Z=125.02的离子流也较稳定，说明3种方式提取盐肤木果油中均含有多酚类物质——没食子酸（图2）。

2.2 HPLC紫外检测含量测定结果

2.2.1 没食子酸标准系列的HPLC图谱及标准曲线没食子酸标准系列的HPLC图谱及标准曲线见图3、图4。

2.2.2 各样品中没食子酸的HPLC图谱及其含量 3种样品在没食子酸标准品相同色谱条件下的HPLC图谱见图5，将各自峰面积数值输入标准曲线的回归方程，计算出各自的没食子酸含量（表3）。

由表3可见，3种样品中均检测到没食子酸的存在，其含量在69.5～434.4 mg/L之间;但不同样品中没食子酸含量差异显著，即提取盐肤木果油的方式不同，其油脂中含没食子酸的多少不同，其中以乙醚浸提油中样品中没食子酸最多，达（426.7±7.7）mg/L。

3 讨论

采用UPLC-MS定性分析可以确定不同提取方法所得盐肤木油脂中均含有没食子酸，该方法正是目前对未知成分定性分析的通用的方法，也是较准确的方法之一。而HPLC的紫外检测定量分析更是较普及的定量检测方法之一。

从分析结果可以看出，盐肤木果油提取方法不同，其中所含没食子酸的量存在显著差异，乙醚浸提盐肤木果油中含量是压榨法或超临界CO2萃取法所得盐肤木果油中的7～8倍之多，可能的原因：一是没食子酸性质决定的，没食子酸易溶于热水、乙醇、乙醚，而不溶于苯、石油醚等[14]，因此，乙醚提取盐肤木果油时，没食子酸也就留在了油脂中。二是不同提取方式提取盐肤木果油所用的原料盐肤木果实的材料来源于不同批次，也就是不同植株的盐肤木果实，这些原材料中所含没食子酸含量也可能有所差异。因此，盐肤木不同植株或不同生长环境条件下其果实中的没食子酸含量，也有待深入研究。

参考文献

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第45卷第1分册）[M].北京：科学出版社，1980：100-101.

[2]宋立人，洪恂，丁绪亮，等.现代中药学大辞典[M].北京：人民卫生出版社，2001：1691-1693.

[3]李肖玲，崔岚，祝德秋.没食子酸生物学作用的研究进展[J].中国药师，2004，7（10）：767-769.

[4]赵军，崔承彬，蔡兵，等.国产盐肤木属植物的研究进展[J].解放军药学學报，2006，22（1）：48-50.

[5]刘玉兰，王小磊，刘海兰，等.盐肤木果及其果油与籽油品质比较[J].食品科学，2018，39（20）：197-201.

[6]陈存武，张莉，何晓梅，等.盐肤木果实常规营养成分分析[J].畜牧与饲料科学，2010，31（4）：2-5.

[7]闵运江，王广林，黄燕.UPLC-MS法对盐肤木果实及其油脂中漆酚成分的分析[J].皖西学院学报，2019，35（5）：74-80.

[8]陈存武，张莉，何晓梅，等.盐肤木总黄酮的提取研究[J].湖南农业科学，2010（13）：119-122.

[9]胡湘蜀，寇兴然，苏建辉，等.液质联用法同时测定茶多酚中17种多酚物质[J].分析实验室，2015，34（7）：822-826.

[10]丁轲，胡婉珊，郭琳博.基于液质联用检测柿子多酚成分的分离与鉴定[J].中国农学通报，2012，28（24）：270-277.

[11]张婷，刘庆焕，王文彤.UHPLC-ESI-MS/MS测定复方景川片中6种成分的含量[J].中国现代应用药学，2018，35（11）：1627-1631.

[12]曾亚，李柯翱，魏玉洁，等.HPLC法测定固龈液药渣提取物及没食子乳膏中 没食子酸和鞣花酸的含量[J].化学与生物工程，2019，36（6）：62-65.

[13]林世和，柯常胜，徐海星，等.HPLC法同时测定大黄炭中没食子酸和5-羟甲基糠醛的含量[J].中国药师，2019，22（6）：1177-1179.

[14]王之德.重要精细化学品——没食子酸[J].天然气化工，1995，20（1）：38-42.