冷鲜鸡接触者手部抗生素耐药菌菌群多样性分析

黄柳娟 邵 毅,2 冯 博 周昌艳,2

(1. 上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403； 2. 上海市设施园艺技术重点实验室，上海 201403)

抗生素耐药细菌(antibiotic resistant bacteria，ART bacteria)在医疗和农业养殖中的快速增多对人类公共卫生安全造成巨大威胁[1]，ART致病菌在医院的接触转移及控制策略方面得到了深入研究[2]，手卫生成为控制院感多重ART菌的重要手段[3-4]。在农业养殖和肉品加工领域，动物源性ART菌可能通过食物链[5]或在养殖、加工和消费各环节[6]向人类扩散，预示耐药风险同样存在于并未滥用抗生素的普通民众中。研究人员[7]从食品加工者的手上分离到了多重耐药的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，但除此以外，动物源ART菌向食品从业人员或消费者手部迁移的研究还未展开。相对于致病菌，普通细菌数量众多，且包含的耐药基因(antibiotic resistance genes，AR genes)和迁移元件更为多样，不同种属细菌的耐药程度[8]和耐药性迁移潜势[9-11]差异巨大，因此肉品加工者手部ART菌菌群组成的揭示，是评估其耐药性暴露风险的基础之一。

目前，在养鸡场和生鲜鸡肉产品表面已发现了大量的四环素耐药菌和磺胺耐药菌，且存在AR基因在不同菌种间迁移的潜势[12-15]。研究模拟冷鲜鸡生产加工和消费初加工中操作人员徒手接触鸡肉的过程，以四环素类耐药菌和磺胺耐药菌为例，拟通过选择性培养和IonS5TMXL测序平台分析手部ART菌的菌落结构，为进一步揭示鸡肉加工操作人员的抗生素耐药暴露风险提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

冷鲜鸡肉产品：科宝500或浦东鸡，上海大型超市和生鲜超市。随机选取上海市6个大型超市和生鲜超市，每个超市购买1份冷鲜鸡样品(2份鸡翅中，2份鸡大胸，2份鸡腿，每类包括散装和预包装样品各1份，共6份，分别编号为A～F)。样品用无菌袋盛装，采样时避免外源污染微生物，在冰盒(约4 ℃)中于3 h内运回实验室，用于徒手接触鸡肉的模拟试验；

脑心浸液肉汤(Brain heart infusion broth, BHI)琼脂培养基：英国OXOID公司；

四环素(Tetracycline，TET)、磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole，SUL)和甲氧苄啶(Trimethoprim，TRI)：分析纯，美国SIGMA公司；

真菌抑制剂放线菌酮(Cycloheximide，CYC)：分析纯，美国AMRESCO公司；

Swab涂抹棒：3M中国有限公司；

细菌基因组提取试剂盒、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)试剂盒和琼脂糖电泳试剂盒：北京全式金生物技术有限公司；

PCR产物电泳凝胶回收试剂盒：美国Thermo Scientific公司；

PCR引物：100 μmol，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

生物安全柜：1300 SERIES A2型，美国Thermo公司；

恒温培养箱：Medcenter Einrichtungen GmbH型，德国Friocell公司；

灭菌锅：SX-500型，日本Tomy Digital Biology公司；

超微量分光光度计：NanoDrop 2000c型，美国Thermo公司；

离心机：5424型，德国Eppendorf公司；

单道可调量微量移液枪：Research Plus型，德国Eppendorf公司；

水平核酸电泳系统：Mini-Sub cell GT型，美国Bio-rad公司；

凝胶成像系统：Criterion Stain Free型，美国Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 徒手接触鸡肉的模拟和取样 参考Zapka等[16]的方法对冷鲜鸡生产加工和消费初加工中操作人员徒手接触鸡肉的过程进行模拟和取样，具体修改：6位操作者均用洗手液充分洗手2 min并冲净后，用75%酒精棉擦拭手掌，然后用涂抹棒翻转充分擦拭手心5 cm×5 cm区域后，放入10 mL缓冲蛋白胨水溶液，反复震荡，获得第1份手心细菌悬浊液样品，编号为WH-1，WH-2，…，WH-6。6位操作者分别徒手各抓取1份冷鲜鸡样品(第1位操作者抓取鸡肉样品A，第2位抓取B，以此类推)，并一直保持手掌与肉接触并揉搓2 min后，再次用涂抹棒擦拭手心，获得第2份手心细菌悬浊液样品，编号为MP-1，WP-2，…，MP-6。

1.2.2 手部ART菌的分离和计数 参考Huang等[17]的方法对四环素耐药菌(TETr)和磺胺甲恶唑/甲氧苄啶耐药菌(SULr)进行分离：手心细菌悬浊液原液经10倍稀释后，用移液枪吸取1 mL原液及各稀释液，均匀涂布于含有CYC+TET或CYC+SUL+TRI的BHI平板上，30 ℃培养24 h。手心细菌悬浊液原液的平板培养物用于菌群多样性分析，分离出单菌落的平板用于菌落计数。所有处理重复3次。参考美国临床和实验室标准协会(CLSI)[18]对四环素或磺胺甲恶唑/甲氧苄啶耐药折点的规定，将培养皿中TET、SUL和TRI的浓度点分别定为16，76，4 μg/mL；所有平板中CYC的浓度均为100 μg/mL。

1.2.3 DNA提取及PCR扩增 刮取原液培养皿上所有菌体，用2 mL生理盐水重悬，混匀，取100 μL菌悬液提取细菌总DNA。经1%琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪分析确认DNA的提取质量后，使用带 Barcode的特异引物对16S rDNA的V3-V4区进行PCR扩增。上游引物为341F：5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’，下游引物为806R：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’。用2%琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪检测PCR扩增产物的质量，委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司利用单端测序(Single-End)的方法，基于IonS5TMXL测序平台[19]，对构建的小片段文库进行高通量测序。

1.2.4 高通量测序数据分析 将下机数据导出fastq文件，根据barcode序列区分各个样本的数据，嵌合体过滤后得到用于后续分析的有效数据[20]。用Uparse软件(Uparse v7.0.1001)以97%的一致性对所有样本的有效标签进行操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)的聚类[21]，用SILVA132(http://www.arb-silva.de/)的SSU rRNA数据库[22]在界、门、纲、目、科、属和种7个水平进行物种注释分析。进而，用Qiime软件(Version 1.9.1)计算物种数指数(Observed species)、超指数(Chao1)、香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)和菌群覆盖度指数(Goods coverage)等α-多样性指数，评估样品的复杂度，生成各分类水平下各类细菌的丰度[19]。其中，Observed Species指数和Chao1指数反映了样品的菌群丰度，Shannon指数和Simpson指数反映了样品的菌群多样性，Goods Coverage指数反映了测序深度。用R软件绘制花瓣图，获得不同样本的共有菌群[23]OTUs信息。

1.3 数据处理

手部ART菌的计数结果用(平均值±标准误差)表示，用SPSS 16.0的单因素方差分析(one-way ANOVA)方法比较徒手接触鸡肉前后手部ART菌计数的差异显著性，当P<0.05时，判断差异显著，否则不显著。

2 结果与分析

2.1 菌群计数

接触冷鲜鸡肉前经充分洗手后，用BHI培养基在6位操作者的手部仅检出约11～99 CFU/cm2的细菌，未检出TETr菌或SULr菌；与冷鲜鸡接触后，操作者手部的两种ART菌分别显著增加到1.14×102～2.66×106，4.80×10～3.40×105CFU/cm2(图1，P=0.000)，说明通过直接接触，冷鲜鸡肉产品表面的两类ART菌均有转移到操作者的手部。因此，用高通量测序技术对迁移至手部的两类ART菌进行组成的多样性分析。

2.2 菌群多样性分析

2.2.1 样品复杂度 所有样品中两种ART菌的菌群覆盖度指数为0.999～1.000(表1)，说明几乎所有的目标序列都被测出，多样性分析结果能反映样品菌群组成的真实情况。从所有6位操作者手部ART菌样品测序共获得400种不同的OTUs，平均每个样品的TETr菌和SULr菌中分别获得159，188个OTUs。

2.2.2 菌群结构 在门水平上，ART菌中丰度最高的3个门均为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)；在属水平上，TETr菌和SULr菌中各注释出79，97种已明确属名的属。与冷鲜鸡表面细菌的主要菌属[24-25]相比，10种主要菌属中除了黄杆菌属(Flavobacteriumspp.)未在试验涉及的手部细菌样品中发现外，其余9种均得了鉴定，再次验证了接触冷鲜鸡后操作者手部分离到的ART菌主要来自冷鲜鸡表面，同时，也间接说明了冷鲜鸡表面的细菌有多种菌属可能已具有抗生素耐药性。此外，有研究[10-11]表明，肉杆菌属(Carnobacteriumspp.)、肠球菌属(Enterococcusspp.)、乳杆菌属(Lactobacillusspp.)、乳球菌属(Lactococcusspp.)和葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)等种属的细菌较多地参与了AR基因的水平迁移，而在试验中，上述种属的细菌在手部分离到的两类ART菌中均有检出，因此有必要在今后的研究中进一步确认这几类ART菌的手部分离株的耐药性，并评估其参与动物源AR基因向人类共生菌迁移的风险。

字母不同表示同个样品的同类细菌中，WH组和MP组差异显著(P<0.05)

操作者编号检出OUT种类数TETrSULr物种数指数TETrSULr超指数TETrSULr香农指数TETrSULr辛普森指数TETrSULr菌群覆盖度指数TETrSULr1157186121127130.69138.084.174.010.910.871.0001.0002162150121115125.19119.094.584.580.930.931.0001.000312722596117100.26137.753.473.110.860.791.0000.99941381399394101.26100.553.232.730.810.721.0001.0005179229128139135.67150.353.644.220.820.891.0001.0006190199131140144.94151.714.164.410.900.921.0001.000

2.2.3 共有菌群 共有菌群在6位操作者的手部细菌样品中均有检出，反映所有样品的菌群组成共性[23]，推测其在冷鲜鸡中普遍存在，对冷鲜鸡加工操作者来说暴露风险较高。花瓣图分析结果表明，TETr菌和SULr菌各有70种OUTs的共有菌群(图2)，除各自的10，7个OUTs未鉴定到属水平外，其他OUTs分属3个门的21，19个属(图3)。

在冷鲜禽肉操作者手部分离到的TETr菌和SULr菌的共有菌群中，不动杆菌属(Acinetobacterspp.)[26]、假单胞菌属(Pseudomonasspp.)[27]、沙雷氏菌属(Serratiaspp.)[28]、变形杆菌属(Proteusspp.)[29]、气单胞菌属(Aeromonasspp.)[30]、柠檬酸杆菌属(Citrobacterspp.)[31]、寡养单胞菌属(Stenotrophomonasspp.)[32-33]、香味菌属(Myroidesspp.)[34]、漫游球菌属(Vagococcusspp.)[35]和巨型球菌属(Macrococcusspp.)[36]的禽源分离株已被证实具有多重耐药性，且可能存在AR基因水平迁移的风险。同时，人类的临床数据[2]表明，除气单胞菌属、漫游球菌属和巨型球菌属外，上述其他属的细菌近十几年来的检出率呈上升趋势，且具有多重耐药性，其中的鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)更是已成为中国目前最主要的“超级细菌”[37]。而气单胞菌也可导致人类肠道感染，是中国夏季腹泻的常见病原菌之一[38]；河流漫游球菌与人类感染有关[39]。因此，应特别注意这些在鸡和人类中都能分离到的ART菌，禽源和人源分离株之间是否存在AR基因迁移的可能需要进一步深入研究和确认。

图2 手部TETr菌和SULr菌中共有和特有OTUs数的花瓣图

图3 TETr菌共享菌群和SULr菌共有菌群的组成

除了上述菌属，试验中冷鲜鸡肉加工操作者手中发现的共有TETr菌和SULr菌中的布丘氏菌属(Buttiauxellaspp.)、丛毛单胞菌属(Comamonasspp.)、摩根氏菌属(Morganellaspp.)、普罗维登斯菌属(Providenciaspp.)、假苍白杆菌属(Pseudochrobactrumspp.)、莫勒菌属(Moellerellaspp.)、Koukoulia属、稳杆菌属(Empedobacterspp.)、Soonwooa属、Sulfuricurvum属、肉杆菌属、库特氏菌属(Kurthiaspp.)、魏斯氏菌属(Weissellaspp.)和赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillusspp.)等菌属的禽源耐药菌株和耐药特性尚未见报道，需要在后续的研究中对相应的菌株进行分离和验证。

试验利用高通量测序技术证实鸡肉表面的多种TETr菌和SULr菌能通过直接接触的途径从冷鲜鸡肉产品表面迁移至操作者手上，但因为两类ART菌的获得仍基于选择性培养基的筛选，而不同的培养参数均会影响细菌的分离结果[40]，因此，单一的培养条件会限制微生物多样性分析结果的全面性，冷鲜鸡产品中能通过直接接触向人类迁移的ART菌的种属，还需配合其他培养方法或开发不依赖于培养的分析技术进行完善。此外，尽管人类皮肤暴露于各种环境下，但皮肤微生物群落仍倾向于保持一定的稳定性[41]，通过直接接触而迁移到人类手部的动物源ART菌能在手部皮肤表面定殖时间，以及从人类手部有效地去除这些动物源ART菌的方法值得进一步研究。

3 结论

试验通过模拟冷鲜鸡生产加工和消费初加工中操作人员徒手接触鸡肉的过程，用选择性培养、菌落计数和菌群多样性分析等方法，证实了TETr菌和SULr菌两类ART菌在直接接触中能从冷鲜鸡肉产品表面迁移至操作者手部。其中的不动杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、变形杆菌属、气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、寡养单胞菌属、香味菌属和漫游球菌属的禽源和人源分离株已被多次证实具有多重耐药性，因此，应充分重视冷鲜鸡肉表面细菌的抗生素耐药性问题，并深入研究AR基因在上述禽源和人源细菌间水平迁移的潜在风险；共有菌群中的布丘氏菌属等14种菌属的禽源耐药株的耐药特性应进一步确认，其污染来源和迁移风险有待揭示。