酶法改性对核桃谷蛋白微观结构及功能特性的影响

薛雨菲 张 玥 程怡媚 马舒婕 孙 乾 李 芳 孔令明

(1. 新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052； 2. 新疆轻工职业技术学院，新疆 乌鲁木齐 830021)

中国核桃产量已居世界首位，除鲜食外，大部分的核桃被用作榨油，但榨油后副产物的综合利用，以及优质核桃蛋白的规模化、集约化深加工仍存在一定的不足。核桃蛋白中的谷蛋白与醇溶蛋白占总蛋白的70%～80%，且谷蛋白只溶于稀酸或稀碱溶液中，不溶于水或油，相对活性差，导致核桃蛋白在食品领域中的应用较少[1]。

酶解可使深藏于蛋白质内部的亲水性基团逐渐暴露而改善蛋白质的功能特性[2-3]。谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，TG)的交联化能促进蛋白质分子向超大型、网状化形成，从而使得蛋白分子具有更为强劲的凝胶化性能[4]。Hu等[5]在研究中指出，酶法可改善蛋白质的乳化活性，但相应的乳化稳定性却有一定程度的下降。酶法改性能使改性后的大豆蛋白在乳化稳定性[6]、起泡性、凝胶性以及热稳定性上有较为显著的改变，因此对蛋白质进行酶法改性并分析蛋白质分子的构象，对解释蛋白质结构与其功能特性的关系，以及扩大在食品等领域的应用具有一定的重要意义[7]。

试验拟选用TG酶改性核桃蛋白，辅以光谱图分析，探究蛋白亲疏水性的变化，定性定量分析蛋白的二级、三级结构以及基团变化，旨在为酶法改性核桃蛋白使核桃饼粕中的优质蛋白得到更为全面的利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃饼粕：新疆中亚食品研发中心有限公司；

核桃谷蛋白(WG)：实验室自制；

大豆油：新疆友好集团股份有限公司；

复合蛋白酶：120 U/mg，南宁庞博生物工程有限公司；

谷氨酰胺转氨酶：100 U/g，北京索来宝科技有限公司；

透析袋：截留相对分子质量8 000～14 000，北京卓立汉光仪器有限公司；

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、NaOH、HCl：分析纯，天津致远化学试剂有限公司；

1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)、5-5’-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)、乙二胺四乙酸(EDTA)：分析纯，美国Sigma公司；

其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

便携式数显pH计：Testo205型，德图仪表(深圳)有限公司；

电子天平：PL203型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

电热恒温水浴锅：DZKW-S-6型，北京市永光明医疗仪器有限公司；

低速离心机：TDL-5-A型，上海安亭科学仪器厂；

紫外—可见分光光度计：TU-1810PC型，北京普析通用仪器有限责任公司；

电热鼓风干燥箱：DHG-9140A型，上海一恒科学仪器有限公司；

真空冷冻干燥机：ALPHA 1-2型，德国 Marin Christ公司；

定时恒温磁力搅拌器：RSH-1DR型，上海贝仑仪器设备有限公司；

漩涡振荡器：GL-866型，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

圆二色谱仪：J-810型，日本JASCO公司。

1.3 试验方法

1.3.1 核桃谷蛋白及改性蛋白的制备

(1) 核桃谷蛋白工艺提取：根据文献[8]进行修改。

核桃饼粕→脱脂核桃粕→加去离子水→离心→沉淀→加NaCl→离心→沉淀→加70%乙醇→离心→沉淀→加NaOH调pH值→离心→上清液→加HCl调pH至等电点→离心→沉淀→水洗至中性→真空冷冻干燥→核桃谷蛋白

(2) 脱酰胺谷蛋白工艺流程：

WG→制备溶液(蛋白质浓度6%～8%，质量分数)→搅拌→调pH 7.0→加酶(40 ℃，40 min，酶用量0.3%)→灭酶(90 ℃水浴10 min)→冷却→水洗至中性→真空冷冻干燥→脱酰胺酶解核桃谷蛋白(CPMP)

(3) 交联化工艺流程：

WG→加磷酸缓冲液溶解(蛋白质浓度6%～8%，质量分数)→搅拌→加酶→混匀振荡反应→灭酶(90 ℃水浴10 min)→冷却→水洗至中性→真空冷冻干燥→TG酶改性核桃谷蛋白(TGMP)

1.3.2 荧光分光光度分析 根据文献[9]修改如下：将蛋白稀释于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，使其质量浓度为0.3 mg/mL。调整激发波长为310 nm，发射波长为450 nm，选择发射波长的测定范围为400～500 nm。激发和发射狭缝均为5 nm，扫描速率1 200 nm/min，扫描电压450 mV。每个样品重复做3次扫描。

1.3.3 紫外分光光度分析 将蛋白稀释于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，使其质量浓度为0.1 mg/mL。取约5 mL样液倒入1 cm石英比色皿中，用分光光度计测定样品吸光度值，扫描波长200～400 nm。每个样品重复做3次扫描。

1.3.4 巯基与二硫键测定

(1) 游离巯基含量：取30 mg蛋白样品分散于Ellman’s试剂中， 4 800 r/min离心15 min，412 nm处测量，每个样品重复做3次测定。

(2) 总巯基含量：称取30 mg蛋白溶于10.0 mL混合试剂(精确称取20.84 g Tris、13.51 g甘氨酸、2.98 g EDTA二钠和960.96 g碳酰二胺，加去离子水定容至1 000 mL)中， 412 nm处测量，每个样品重复做3次测定。按式(1)计算巯基含量。

(1)

式中：

SH——巯基含量，μmol/g；

73.53——消光转化系数，μmol/L；

A412——412 nm处测得的吸光度；

D——上清液稀释倍数；

C——上清液中蛋白含量，mg/mL。

(3) 二硫键：取50 mg蛋白样品分散于100 μL Tris-base缓冲液中，再加入到NTSB溶液中，室温下静置1 h，10 000 r/min离心10 min，412 nm处测量，对照组加入NTSB溶液。

1.3.5 圆二色光谱分析 精确称取WG样品溶解于pH 7.0的磷酸缓冲液中，使蛋白浓度为0.3 mg/mL。在25 ℃条件下放置3 h，采用圆二色光谱仪测定WG的圆二色性。取约5 mL样液置于2 mm石英比色皿中，扫描波长190～250 nm，扫描速率100 nm/min，响应温度25 ℃，灵敏度100 mdeg/cm，分辨率0.5 nm。所测出的图谱需扣除缓冲液的空白差，每个样液重复扫描8次取平均值，蛋白的二级结构采用JASCO结构软件进行分析，圆二色性以残基摩尔椭圆率表示(℃·cm2/dmol)。

1.3.6 氮溶指数的测定 参照文献[10]并做一定修改，精确称量2 g冻干后的酶解产物，分散于去离子水中，定容至50 mL。室温下振荡2 h，4 500 r/min离心20 min，取5 mL上清液用凯氏定氮法测定蛋白质含量，每个样品重复做3次测定。按式(2)计算氮溶指数。

(2)

式中：

NSI——酶解产物的氮溶指数，%；

N1——5 mL上清液中的可溶性氮，mg；

N2——2 g样品中的总氮，mg；

1.3.7 持水性的测定 参考Paredeslopez等[11]的方法并略作修改，准确称取0.10 g WG和改性蛋白置于离心管中，加入10 mL去离子水，4 500 r/min离心15 min。称取样品和离心管质量，每个样品重复做3次测定。按式(3) 计算持水性。

(3)

式中：

WHC——持水性，g/g；

M0——样品质量，g；

M1——离心管与样品总质量，g；

M2——离心管与沉淀物质量，g。

1.3.8 持油性的测定 依照Pedroche等[12]的方法并略作修改，准确称取0.10 g WG和改性蛋白置于离心管中，加入大豆油5 mL，漩涡式震动60 s，3 300 r/min离心15 min，吸纸吸去残留油脂，每个样品重复做3次测定。按式(4)计算持油性。

(4)

式中：

FBI——持油性，g/g；

M0——样品质量，g；

M1——离心管与样品总质量，g；

M2——吸油后离心管与样品总质量，g。

1.3.9 乳化及乳化稳定性的测定

(1) 乳化性：根据文献[13]略作修改。取5 mL样液于25 mL蒸馏水和20 mL大豆油混合液中，漩涡震荡60 s，2 500 r/min离心乳化5 min，读取乳化层高度，测定3次取平均值。按式(5)计算乳化性。

(5)

式中：

EA——乳化性，%；

H1——离心管中乳化层高度，cm；

H——离心管中液体总高度，cm。

(2) 乳化稳定性：称取5 g样品溶于100 mL蒸馏水中，调节至pH 7.0，加入50 mL大豆油，高速搅拌器中10 000 r/min 均质2 min，50 ℃水浴30 min后，测出此时的乳化层高度，并且记录30 min后的乳化层高度。测定3次取平均值。按式(6)计算乳化稳定性。

(6)

式中：

ES——乳化稳定性，%；

H0——0 min乳化层高度，cm；

H1——30 min乳化层高度，cm。

1.3.10 起泡性与泡沫稳定性的测定 根据文献[14]修改如下，按1%的质量浓度将样品溶解于pH 7.0的10 mmol/L 磷酸缓冲溶液中，取10.0 mL置于25 mL离心管中，10 000 r/min均质2 min；快速记录均质停止时的总体积和放置30 min后的总体积，测定3次取平均值。按式(7)、(8)分别计算起泡性与泡沫稳定性。

(7)

(8)

式中：

FA——起泡性，%；

FS——泡沫稳定性，%；

V0——初始样液体积，mL；

V1——均质放置0 min后样液总体积，mL；

V2——均质放置30 min后样液总体积，mL。

1.4 数据处理

所有试验重复3次，运用Excel 2003进行图形绘制，光谱图采用系统自带软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 荧光光谱分析

由图1可知，在310 nm的激发波长处所产生的荧光光谱主要是由于谷蛋白中存在一定量的色氨酸所造成的，谱图上显示的荧光峰实质为色氨酸基团由于光激发产生的电子跃迁所导致，峰的位置为428～432 nm。利用CPMP与TGMP适度地酶解蛋白，使蛋白分子水解成多肽以及肽链，打开了蛋白质卷曲的结构，分子链逐渐展开，侧链的改变会影响蛋白质三级结构的变化[15]。改变蛋白质内部结构以及蛋白质所处的微环境，都可以使蛋白质中氨基酸发生相应变化，一部分色氨酸从疏水性区域游离到亲水性区域，其氨基酸残基暴露在极性环境下，导致其荧光强度下降；另一部分色氨酸逐渐被包埋于分子内部，其所处的微环境极性降低，也导致了荧光强度下降[16]。亲水性基团的暴露，疏水基团的包埋，使得亲水性极大增强，溶解度极大提高。

图1 核桃谷蛋白与改性蛋白的荧光光谱

2.2 紫外光谱分析

由图2可知，WG的最大紫外吸收波长为284 nm，反映了WG的紫外吸收主要是其蛋白内的色氨酸和络氨酸残基发生必变所引起的。WG的最高紫外吸收峰出现在284 nm处的0.470，而CPMP是0.498，其高低顺序依次为TGMP>CPMP>WG。所有改性蛋白的吸收峰均出现在275～279 nm，蛋白紫外吸收峰出现了蓝移，说明色氨酸、络氨酸等残基基团所处微环境的极性状态发生了改变，这种改变也相应会引起肽键的断裂[17]。

图2 核桃谷蛋白与改性蛋白的紫外光谱

2.3 巯基与二硫键分析

由图3可知，WG的游离巯基和二硫键含量分别为22.78，7.02 μmol/g。WG的大部分巯基都游离在蛋白质表面，而改性蛋白的巯基相对WG均是包埋在分子内部。在蛋白质空间结构中，巯基和二硫键是维持蛋白分子空间结构稳定以及改变一定功能特性的重要化学键[18]，这些化学键的断裂、结合、重组都可使蛋白质的更高级结构产生一定的变化，而这些变化往往又与蛋白质的功能特性紧密结合。

2.4 圆二色光谱分析

如图3所示，210 nm处的负峰显示了蛋白质具有α-螺旋结构，而α-螺旋结构过于稳定，在一定程度上会阻止蛋白的构象发生改变，蛋白质趋于稳定状态，不利于蛋白质功能特性的改变[19]；相比α-螺旋结构，β-折叠与无规则卷曲结构使得蛋白稳定性较差。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

图4 核桃谷蛋白与改性蛋白的圆二色光谱

由表1可知，未改性的WG二级结构主要为β-折叠，且α-螺旋结构占17.62%，为改性蛋白的1.27倍。经酶法改性的CPMP与TGMP虽有一定变化趋势，但表现不明显；β-转角结构在整体上变化不明显，无规则卷曲结构在一定程度上有所变化。

2.5 功能指标的测定

由表2可知，通过改性前后的数据对比分析，CPMP与TGMP的氮溶指数分别为40.61%，34.29%，氮溶指数提高了133.01%，96.75%，持水性提高了23.19%，22.25%，与沈敏江等[20]的研究结果一致。Tsumura等[21]研究发现，酶法改性可有效改善大豆蛋白的功能特性，主要与蛋白质的水解和交联有关；沈敏江等[20]研究发现氮溶指数由8.74%上升至78.16%。

CPMP与TGMP的持油性均出现了一定的下降，可能是因为酶法改性较为温和，在暴露亲水基团的同时也在释放疏水性基团，而预先暴露出来的亲水性氨基酸阻止了疏水性氨基酸的暴露，导致疏水性氨基酸不能完全暴露，持油性较差。TG酶的催化作用会导致蛋白质的二级和三级结构发生变化，随着多肽的产生和肽链的舒展，更多的疏水基团与疏水区域的暴露会直接增加蛋白的持油性，但提高幅度并不明显；而因为TG酶所产生的交联化作用，其空间网络结构逐渐紧密，且TG酶也相应发生脱酰胺化，因此也会提升蛋白的持水性。杨淼等[22]认为，在水油两相比中，适当提高油相比例可以提高大豆分离蛋白的凝胶持水性，提高大豆分离蛋白的乳化性状；而在大豆蛋白的相应产品中，TG酶常被用作一种凝胶乳化剂以提升产品的乳化能力和胶凝程度[23]。

表1 核桃谷蛋白与改性蛋白二级结构变化对比

表2 改性前后功能特性比较

在乳化特性与起泡特性上，采用酶法改性处理WG能够提高氮溶指数，同时对乳化特性有一定程度的提高。Guan等[24]指出，一般情况下，蛋白质的溶解性较好，蛋白的其他功能特性也相应较好；而沈敏江等[20]却认为，使用酶法改性WG，虽然其乳化性有一定提升，但乳化稳定性却呈现出显著下降，并指出可能是因为酶解破坏了核桃蛋白的内部结构，导致非极性基团逐渐暴露，因为酶解也会相应生成多肽和小分子肽，这些肽类黏滞在油分子表面，阻止了核桃蛋白的乳化稳定性。

由表2还可知，CPMP与TGMP的起泡特性无明显变化。Kong等[25]发现有限的酶解可使蛋白质分子向多肽转变，而多肽链相比蛋白质具有较高的表面活性，而这种活性会促使核桃蛋白功能特性有所改善。Gan等[26]则发现TG酶对小麦蛋白的改性会显著提高蛋白的乳化性、起泡性以及凝胶性，且提高幅度均在55%以上，但其稳定性却都有略微的降低。这是由于TG酶能够对蛋白质中的谷氨酸以及赖氨酸残基产生交联化，这种交联化反应使得蛋白质分子间以及蛋白质分子内都逐渐发生交联，交联促进了蛋白分子的紧密结构，优化了蛋白的空间网络结构，这些原因均改善了蛋白功能特性。

3 结论

研究发现，经复合蛋白酶与TG酶改性后的核桃蛋白其溶解度有较大幅度的提升，持水能力也表现出一定的升高，但持油性却有一定的下降；乳化特性与起泡特性也有相应的变化。结合光谱图的分析，更加明确了核桃蛋白在酶法改性时，蛋白的亲水性以及疏水性会发生相应的变化，蛋白中氨基酸残基的极性状态也会发生相应的变化，其内部的色氨酸与外部环境(pH、温度等)的改变，也会引发蛋白质高级结构的改变；也为核桃的定性分析提供了相应的理论依据。 蛋白的游离巯基是决定亲水性的主要原因，蛋白分子内部以及分子间化学键的变化，能反作用于其所形成的高级结构变化，而结构表征性的变化又会影响到蛋白外在的功能特性的变化。但目前试验仍处于对结构表征的论述，未从蛋白组学的角度出发，对作用于氨基酸位点上的深层次机理加以阐述，且在实际应用中还有待于更深入的开发和完善。