杏鲍菇谷蛋白理化性质及功能特性研究

耿正玮，樊林娟，张咏梅，程艳芬，冯翠萍，*

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西晋中030801；2.临汾市国有企业监事会，山西临汾041000）

杏鲍菇又名刺芹侧耳，是欧洲南部、非洲北部以及中亚地区高山、草原、沙漠地带的一种品质优良的大型肉质伞菌，其味道鲜美、营养价值丰富，对人体具有抗衰老[1]、抗氧化[2]、抗病毒[3]、抗肿瘤[4]等生理功效。杏鲍菇中的蛋白质含量约12.4%～35%，8种必需氨基酸齐全，是一种营养价值很高的食用菌[5]。魏君慧等[6]采用Osborne法分离杏鲍菇中的主要蛋白组分，并研究其理化性质和功能特性。陈雪洋等[7]通过干燥、粉碎、碱提、酸沉、回调、冻干等工艺提取杏鲍菇蛋白质，并对其功能特性进行了分析。本课题组前期试验结果表明：杏鲍菇中谷蛋白含量占总蛋白含量的30.71%，关于谷蛋白的理化性质和功能特性鲜见报道。因此，本试验以杏鲍菇粉为原料，采用Osborne法分离出杏鲍菇谷蛋白，对其分子量、二级结构、巯基含量、变性温度及氨基酸组成进行测定，并研究离子强度、温度、pH值、蔗糖浓度对其功能特性的影响，为杏鲍菇谷蛋白质在食品加工中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杏鲍菇粉：山西农业大学食用菌中心提供；考马斯亮蓝G-250染料试剂：上海源叶生物科技有限公司；5，5，-二硫双（2-硝基苯甲酸）[5，5'-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB]、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）：美国 sigma 公司；色拉油：市售；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

HH-2型电子恒温水浴锅：天津市赛得利斯有限公司；ST3100型酸度计、AR224型电子分析天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司；LD5-2B型高速离心机：北京雷勃尔医疗器械有限公司；UV-120型紫外-可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；GZX-G型漩涡振动仪器：上海跃进医疗器械有限公司；Tensor傅里叶红外变换光谱仪：Bruker；Lab Sys同步热分析仪：法国SE TARAM；Biochro氨基酸自动分析仪：英国百康。

1.3 试验方法

1.3.1 杏鲍菇谷蛋白的提取

称取一定量的杏鲍菇粉，以蒸馏水为提取剂，先提取清蛋白，将提取清蛋白后的沉淀用3%NaCl浸提球蛋白，将提取球蛋白后的沉淀用70%乙醇浸提醇溶蛋白，将提取醇溶蛋白后的沉淀用1%NaOH浸提得到谷蛋白。

1.3.2 杏鲍菇谷蛋白理化性质研究

1.3.2.1 等电点的测定

将提取醇溶蛋白后的沉淀按一定的料液比加入0.01 mol/L NaOH溶液，调节pH值提取谷蛋白，离心后分别吸取10.0 mL上清液于9个离心管中，调节各上清液的pH值，以pH4.1开始按照0.1的梯度进行调节最终至5.0，在4500r/min离心20min，取上清液1.0mL，用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质含量，蛋白质含量最低时的pH值即为等电点。

1.3.2.2 巯基含量的测定

1）二硫键的测定：

式中：A412为412 nm条件的吸光值；ε为分子吸光度13 900[（mol×cm）/L]；D为稀释倍数。

2）自由巯基的测定：

式中：A412为412 nm条件的吸光值；ε为分子吸光度13 900[（mol×cm）/L]；D为稀释倍数。

3）总巯基的测定：

式中：A412为412 nm条件的吸光值；ε为分子吸光度13 900[（mol×cm）/L]；D为稀释倍数。

1.3.2.3 二级结构的测定

取谷蛋白固体样品2.0mg、光谱醇KBr约200.0mg，在玛瑙研钵中研磨至细腻的粉末状，取适量样品分散系置于压片模具中，将压片模具置于压片机上，在一定的压力下压制成薄片，在光谱仪中做全波长扫描。

1.3.2.4 变性温度的测定

采用示差量热扫描（differential scanning calorimetry，DSC）仪测定杏鲍菇谷蛋白变性温度，称取谷蛋白固体样品10.0 mg于样品皿中，用压样机封样，进行扫描。

1.3.2.5 氨基酸组成的测定

参照GB/T 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》方法，准确称取杏鲍菇谷蛋白冻干粉，将蛋白质经盐酸水解成游离氨基酸，利用氨基酸分析仪对杏鲍菇谷蛋白氨基酸进行测定。

1.3.3 杏鲍菇谷蛋白功能特性研究

1.3.3.1 离子强度对蛋白质功能特性的影响因素

配制浓度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的NaCl溶液，分别测定不同浓度的NaCl溶液对谷蛋白的溶解性（solubility，S），持水性（water holding capacity，WA），持油性（oil holding capacity，FA），起泡性（foam capability，FC）及起泡稳定性（foam stability，FS），乳化性（emulsion capability，EC）及其乳化稳定性（emulsification stability，ES）的影响。

1.3.3.2 温度对蛋白质功能特性的影响因素

将处理好蛋白液置于温度分别置于以30℃开始按照10℃梯度递增到70℃的水浴锅中，加热10 min后取出，待其冷却至25℃后，分别测定不同温度对杏鲍菇谷蛋白S、WA、FA、FC及FS、EC及其ES的影响。

1.3.3.3 pH值对蛋白质功能特性的影响因素

将处理好的蛋白液，用0.01 mol/L的HCl或者NaOH调节溶液pH值，以pH 3.0开始按照0.5梯度递增到5.0，分别测定不同pH值对杏鲍菇谷蛋白S、WA、FA、FC及FS、EC及其ES的影响。

1.3.3.4 蔗糖浓度对蛋白质功能特性的影响因素

分别配制浓度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的蔗糖溶液，测定不同浓度的蔗糖溶液对杏鲍菇谷蛋白S、WA、FA、FC及FS、EC及其ES的影响。

1.3.3.5 功能特性指标测定

1）蛋白含量的测定：采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，根据标准曲线计算待测样品中蛋白含量（g）。

2）溶解性：参照冯笑笑[8]的方法，用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白含量，按下式计算溶解性（S）。

3）持水性：参照庞庭才等[9]的方法，按下式计算蛋白质持水性（WA）。

式中：m为蛋白样品质量，g；m1为离心管和蛋白样品的质量，g；m2为离心管和沉淀物的质量，g。

4）持油性：参照张艳荣等[10]的方法，按下式计算蛋白质持油性（FA）。

式中：m为蛋白质样品的质量，g；m1为离心管和蛋白质样品的质量，g；m2为离心管和沉淀物的质量，g。

5）起泡性及起泡稳定性：照杨华连等[11]的方法，按下式计算其起泡性（FA）及起泡稳定性（FS）。

式中：V初始溶液体积，mL；V0为剪切后0 min的泡沫体积，mL；V30为剪切后30 min的泡沫体积，mL。

6）乳化性：参照林洋[12]方法，按下式计算蛋白质乳化稳定性（ES）及乳化稳定性（ES）。

1.4 数据处理

每份样品重复测定3次，取平均值，使用OriginPro8.5进行数据处理、分析。

2 结果与分析

2.1 杏鲍菇谷蛋白理化性质

2.1.1 等电点

杏鲍菇谷蛋白等电点见图1。

图1 杏鲍菇谷蛋白等电点Fig.1 The protein isoelectric point of Pleurotus eryngii gluten

由图1可知，随着蛋白液pH值的增加，溶液中蛋白含量先迅速减小，在pH值为4.3时蛋白含量达到最小，随着pH值的增加，溶液中蛋白质含量趋于稳步的增长趋势。

2.1.2 分子量

杏鲍菇谷蛋白分子量见图2。

图2 杏鲍菇谷蛋白SDS-PAGE图Fig.2 SDS-PAGE diagram of Pleurotus eryngii albumin and glutelin

由图2可知，谷蛋白分布在30.28、25.39 kDa附近。

2.1.3 巯基含量

蛋白质的空间结构是通过巯基和二硫键维持的，二硫键和巯基可通过氧化还原进行相互的转化，杏鲍菇谷蛋白巯基和二硫键含量见表1。

表1 谷蛋白的巯基和二硫键含量Table 1 Sulfhydryl and disulfide bond contents of glutenin

由表1可知，杏鲍菇谷蛋白总巯基含量为67.06 μmol/g，易与水结合。二硫键是一种共价键，它的形成使蛋白质肽链的空间结构更加紧密，其可通过还原反应转化形成巯基，二硫键的减少使蛋白质的空间结构松散。杏鲍菇谷蛋白二硫键含量相对较高，说明谷蛋白具有很好的热稳定性，在加工过程中热稳定性高。

2.1.4 二级结构含量

杏鲍菇谷蛋白二级结构含量见图3、表2。

图3 杏鲍菇谷蛋白红外光谱图Fig.3 DSC scans of the Pleurotus eryngii glutenin

表2 杏鲍菇谷蛋白二级结构含量Table 2 Secondary structure contents of glutenin in Pleurotus eryngii

由图3可见，2 000 cm-1～1 500 cm-1为双键伸缩振动区，1 659、1 661 cm-1附近的峰说明杏鲍菇谷蛋白在酰胺Ⅰ带有α螺旋；在1631cm-1附近出现的峰说明杏鲍菇谷蛋白在酰胺Ⅰ带存在β折叠；在1 668、1 674 cm-1的峰证明杏鲍菇谷蛋白在酰胺Ⅰ带存在β转角，由表2可知，α-螺旋、β-折叠和β-转角含量分别为31.41%、55.15%、13.45%。

2.1.5 热变性温度

杏鲍菇谷蛋白热变性温度见图4。

图4 杏鲍菇谷蛋白DSC扫描图Fig.4 DSC scan of glutenin in Pleurotus eryngii

由图4可知，谷蛋白的变性温度为73.59℃。不同结构的蛋白质对温度的敏感性不同，在加工过程中，温度的控制及其重要。

2.1.6 氨基酸分析

杏鲍菇谷蛋白氨基酸组成成分见表3。

表3 杏鲍菇谷蛋白氨基酸组成成分Table 3 Amino acid composition list of Pleurotus eryngii glutenin

由表3可知，杏鲍菇谷蛋白中含人体所需的必需氨基酸有缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、苏氨酸，总含量为40.77%，属于优质蛋白质。杏鲍菇谷蛋白中酸性氨基酸的含量占总氨基酸含量的21.07%，分别为：天门冬氨酸、谷氨酸。碱性氨基酸含量占总氨基酸含量的13.75%，分别为：精氨酸、赖氨酸、组氨酸。在中性溶液中，酸性氨基酸带负电，呈酸性，碱性氨基酸带正电，呈碱性。由此可知，谷蛋白中性溶液呈酸性。支链氨基酸是理想的运动补充剂，它通过特殊的方式促进代谢，其中谷蛋白支链氨基酸占总氨基酸组分的23.44%，是较好的运动补充剂。芳香族氨基酸能促进多肽链中蛋白质分子间的相互作用[13]，杏鲍菇清蛋白所测得的芳香氨基酸占总氨基酸组分的18.56%。

2.2 杏鲍菇谷蛋白功能特性研究

2.2.1 离子强度对杏鲍菇谷蛋白功能性质的影响

离子强度对杏鲍菇谷蛋白功能性质的影响见图5。

图5 离子强度对谷蛋白功能性质的影响Fig.5 Effects of ionic strength on the functional properties of Pleurotus eryngii glutenin

由图5中可见，随着离子强度的增大，持水性呈下降趋势；持油性、起泡性、起泡稳定性及乳化性呈先降低后增加的趋势，在离子强度为0.8 g/100 mL时持油性最差，在离子浓度为0.4 g/100 mL时起泡性、起泡稳定性及乳化性最差；溶解性及乳化稳定性呈先上升后下降的趋势，离子强度为0.6 g/100 mL时溶解性和乳化稳定性最好。

2.2.2 温度对杏鲍菇谷蛋白功能性质的影响

温度对杏鲍菇谷蛋白功能性质的影响见图6。

图6 温度对谷蛋白功能性质的影响Fig.6 Effects of temperture on the functional properties of Pleurotus eryngii glutenin

由图6中可知，在测定温度的范围内，除持油性外，溶解性、持水性、起泡性、起泡稳定性、乳化性和乳化稳定性均先增大后减小，在40℃时起泡性和乳化稳定性最好，在50℃时溶解度、持水性及乳化性最好，持油性呈先减小后增大的趋势，在60℃时最差。

2.2.3 pH值对杏鲍菇谷蛋白功能性质的影响

pH值对杏鲍菇谷蛋白功能性质的影响见图7。

图7 pH值对谷蛋白功能性质的影响Fig.7 Effects of pH on the functional properties of Pleurotus eryngii glutenin

图7可见，pH值在4.5时，杏鲍菇谷蛋白的溶解性、持水性、持油性、起泡性和乳化性均为最小值。在等电点两侧呈上升趋势，可溶性蛋白才会有泡沫的形成。当pH值大于或小于等电点时，蛋白质溶液中的带电离子电荷量不同，增加了其在水中的溶解度，同时提高了起泡性。当pH值为4.5时，蛋白液中带电荷离子相等，使得乳化能力处于最低水平。当溶液的pH值不在等电点时，使得蛋白质更容易溶于溶剂，增加了溶解度，这时更有利于蛋白质分子参与乳化作用[14]。乳化作用的增强使得油与水之间更易形成带有电荷的薄膜，这样可以抑制蛋白质形成颗粒或块状物质，乳化性随之提高[15]。泡沫稳定性在等电点附近时升高，可能是因为蛋白质缺乏静电排斥作用，从而使得泡沫稳定性得以升高[16-18]。

2.2.4 蔗糖浓度对杏鲍菇谷蛋白功能性质的影响

蔗糖浓度对杏鲍菇谷蛋白功能性质的影响见图8。

图8 蔗糖对谷蛋白功能性质的影响Fig.8 Effects of sugar on the functional properties of Pleurotus eryngii glutenin

由图8可见，随着蔗糖浓度的增大，杏鲍菇谷蛋白的溶解性、持水性、持油性、起泡性和乳化性呈先增大后减少的趋势，当蔗糖浓度为0.4%、0.6%、0.2%、0.6%、0.6%时分别达到最大值，起泡稳定性和乳化稳定性的变化趋势则与之相反；在蔗糖浓度为0.6%时，稳定性都最差。这可能是由于蔗糖浓度的增大导致溶液体系的粘稠度增加，此时减小了蛋白质分子的运动，不易于蛋白质在界面的展开[19]，因此在高速搅拌时减小了蛋白质产生泡沫的能力，使蛋白质的起泡性下降。

3 结论

杏鲍菇粉中的谷蛋白的等电点为4.3，其亚基分子量分布在小分子范围内，易于被人体吸收，在蛋白质中巯基与二硫键可以通过氧化还原进行互相转化，总巯基、游离巯基、二硫键含量分别为67.06、28.90、14.35 μmol/g，二级结构占比为 α-螺旋 31.41%、β-折叠55.15%、β-转角13.45%，变性温度为73.59℃，含有人体所必需的氨基酸，属于优质蛋白质。离子强度、温度、pH值和蔗糖浓度对杏鲍菇谷蛋白的功能特性均有一定的影响。本研究结果可以为杏鲍菇谷蛋白在食品加工中的应用提供理论依据。