欧洲缬草不定根诱导与悬浮培养的研究

李文杰, 李美阳, 宫惠

(延边大学农学院, 吉林 延吉 133002)

欧洲缬草(ValerianaofficinalisL.)属于败酱科(Valerianaceae)缬草属(Valeriana)多年生草本植物。以根及根茎入药[1]，具有镇静安神、解痉止痛之功效，多用于治疗神经衰弱、失眠、癫痫等[2]，主要药用活性成分是缬草三酯和缬草烯酸[3]。近年来，人们生活节奏加快，生活压力增大，失眠、抑郁、肿瘤等疾病越来越多，而缬草正是一种天然镇静、解痛剂[4]，所以人们对缬草提取物及其制剂的需求日益增加。

问：“这些日子你丈夫没给你打电话？”刘珊珊冷冷地说：“没打，我们虽然是夫妻，却形同陌路，他已经出差半年多了，也不知道去了哪里！”江帆怀疑刘珊珊在骗他，吼道：“我老婆被你老公拐跑了，我今天是来找他算账的。找不到他，我就……”说着，又亮出了匕首！刘珊珊被吓出了眼泪，一脸无辜地哀求：“大哥，我真不知道。我根本管不了他！我连他手机都打不通。”江帆怒不可遏：“我快被你老公搞疯了，再找不到李辉，我就杀了你，看他回不回来……”江帆越说越激动，手中的匕首乱晃！

缬草属植物主要分布于气候温和潮湿的地区，遍布整个欧洲、亚洲北部、南美洲以及美国[5]。自然生长十分缓慢，需求增多导致野生缬草资源急剧下降。建立人工种植生产基地，对缓解和保护野生资源意义重大。但在长期人工栽培过程中，品种退化、混杂现象严重，优质高产的遗传稳定性难以保持，大大影响了药材的质量和产量[6]。所以，采用植物组织培养技术显得十分迫切。

“三农”工作是我国经济工作的重要组成部分，长期以来一直是党的工作的重中之重。在决胜全面建成小康社会的背景下，如何满足农民追求美好生活需求，实施乡村振兴战略是今后解决“三农”问题，全面激活农村发展新活力的重大行动。进一步建立健全城乡融合发展的体制机制和政策体系，加快推进农业农村现代化，才能使农村的“三农”活力被真正激发起来。坚持农业农村优先发展，巩固和完善农村基本经营制度，深化农村集体产权制度改革，保持土地承包关系稳定并长久不变，把中国人的饭碗牢牢端在自己手中，构建现代农业产业体系，促进农村一二三产业融合发展，这些都是推进“三农”建设的根本。

国内外研究表明，许多物种的不定根培养具有稳定合成次生代谢物质的能力[6]，并且已在何首乌等药用植物中得以成功应用[7]，而欧洲缬草正是以根和根茎入药，所以将组织培养技术与欧洲缬草不定根大量繁殖相结合可以快速有效地解决缬草提取物及其制剂供应不足的问题。虽然国内外学者先后开展了缬草的组织培养研究，但大多都是愈伤组织诱导和组培快繁类研究[8]，而对缬草不定根诱导方面的研究多为外植体或者外源激素单一因素，对缬草不定根悬浮培养方面的研究很少。本研究以欧洲缬草无菌苗的叶片和茎段为外植体，研究了不同浓度吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)、萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)、吲哚丁酸(3-indolebutyric acid，IBA)对不定根诱导的影响，将外植体类型和外源激素两种诱导因素相结合，再以诱导的不定根为材料，考察了不同培养基种类、不同外源激素对不定根悬浮培养的影响,旨在筛选欧洲缬草不定根诱导及悬浮培养的理想条件和培养基，利于欧洲缬草不定根的高效生产，为欧洲缬草提取物及其制剂的工业化生产提供参考。

取一定数量的种子在流动水下冲洗30 min，然后在超净工作台中用75%的酒精溶液浸泡消毒30 s，再用4%的次氯酸钠溶液浸泡消毒15 min，浸泡的过程中应不断搅拌，使其能够消毒完全，然后再用无菌水冲洗3～5次后放到无菌滤纸上吸干种子表面水分后，将种子接种到MS固体培养基上，每瓶20粒种子，共30瓶。培养温度为(25±2)℃，光照强度1 200 lx,光照时间12 h。每天注意记录和观察种子发芽时间和发芽率。待无菌苗生长30 d时，从中选取较宽大的叶片(约为2.5 cm×1.0 cm)，切成0.5 cm×0.5 cm大小的叶片作为外植体，再选取粗度均匀的茎(直径约为1.5 mm)，切成1 cm左右不含节间的茎段作为外植体，用于下一步不定根诱导试验。

首先，很多学校由于师资力量的匮乏，导致没有专门的道德与法治教师，这门课程多是由其他科目的教师兼任。但是教师由于缺乏专业的法律常识，只能是依照教材内容进行讲授，不能够深入分析相关案例并普及相关法律知识，导致学生的法治观念薄弱，不利于其综合发展。其次，很多学校的教材内容过于陈旧，案例不够典型，很难真正起到提高学生道德与法治意识的作用，导致学生的成长受阻。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2.1.2不同浓度IAA对不定根诱导的影响 不同浓度IAA对不定根的诱导效果见表2和图1。当以茎段为外植体时，随IAA浓度的增加不定根生根率先降低后稍稍增加之后又大幅度降低，当IAA浓度为0.05 mg·L-1时，生根率最高，达80.56%，并且生根数较多，生长旺盛、不定根粗长；以叶为外植体时，随IAA浓度的增加不定根生根率先增加后降低，当IAA浓度为1.0 mg·L-1时，不定根生根率最高，达85.19%，同时不定根生长旺盛、生根数最多但较细短。从表2可知，外植体为茎段时，生根率、生根外植体数和总根数最高的都是IAA浓度0.05 mg·L-1；外植体为叶片时，生根率、生根外植体数和总根数最高的都是IAA浓度1.0 mg·L-1，并且两者与其他浓度存在显著差异(P<0.05)。但从图1看，茎段为外植体IAA浓度为0.05 mg·L-1的不定根粗长明显优于叶片为外植体IAA浓度为1.0 mg·L-1。综合来看，MS+0.05 mg·L-1IAA是诱导不定根的理想培养基。

1.2 欧洲缬草无菌苗的获得

且夫两汉而下，文之不如古者，岂其所谓绳墨转折之精之不尽如哉？秦汉以前，儒家者有儒家本色，至如老庄家有老庄本色，纵横家有纵横本色，名家、墨家、阴阳家皆有本色。虽其为术也驳，而莫不皆有一段千古不可磨灭之见，是以老家必不肯剿儒家之说，纵横必不肯借墨家之谈，各自其本色而鸣之为言。其所言者，其本色也。是以精光注焉，而其言遂不泯于世。［13］294-295

1.3 欧洲缬草不定根的诱导

1.4.1不同培养基对欧洲缬草不定根悬浮培养的影响 试验所涉及6种培养基(MS、RCM、B5、WPM、SH、White)均为原配方组分，添加30 g·L-1蔗糖，并根据试验需要添加不同种类和浓度的外源激素，pH 5.7，分装后121 ℃下灭菌15 min。选取0.5 mg·L-1NAA浓度下诱导的、粗细均匀的不定根，将其从根尖部位切取1 cm，接种到含有上述6种培养基的50 mL三角瓶中，每瓶接种10个根尖部位，每种培养基10瓶重复。

生根率=生根外植体数/接种外植体数×100%。

1.4 欧洲缬草不定根的悬浮培养

以MS为基本培养基，添加蔗糖30 g·L-1、琼脂8.0 g·L-1，配制成含NAA、IAA或者IBA(3种激素浓度梯度均为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg·L-1)的固体培养基。再将外植体茎段和叶片分别接种到已配制好的培养基中。每种激素浓度下的茎和叶均做10瓶重复，培养温度为(25±2)℃，暗培养。注意观察统计生根外植体数、生根总数以及根形态(肉眼对比观察界定粗细和长短)，计算生根率。

接种前称量培养基总重量，接种时要注意用无菌水将根尖的固体培养基清洗干净，接种后称量培养基总重量，得到接种量。

表2为不同活化条件下酵母菌发酵特性标准化处理值之和（即OI总值），大多高于普通活化所得OI总值（5.82），表明发酵前适应活化处理可提高酿酒酵母菌的发酵特性。

接种量(g)=接种后培养基总重量(g)-接种前培养基总重量(g)。

采用Excel软件整理数据，采用SPSS17.0软件对数据进行统计学分析。

干物率=收获干重/收获鲜重×100%；

1.4.2不同外源激素对欧洲缬草不定根悬浮培养的影响 以RCM为基本培养基，添加蔗糖30 g·L-1，制作含有NAA(浓度分别为0.1、0.5、1.0 mg·L-1)和IAA(浓度分别为0.05 mg·L-1、0.5 mg·L-1)的培养液，选取0.5 mg·L-1NAA下诱导的、粗细均匀的不定根，将其接种到上述培养液中，每种激素浓度10瓶重复。接种注意事项、培养条件及称量方法等同1.4.1节。

1.5 数据统计分析

接种后移至摇床培养，转速为120 r·min-1，培养温度为(25±2)℃，暗培养，30 d后收获。用无菌水将不定根上残留的培养液冲洗干净，用滤纸吸干水分，于分析天平称量，得到收获鲜重(收获量)。在40 ℃干燥箱中干燥至恒重，于分析天平称量，得到收获干重。

人，无论生于哪个时代，处于何方地界，都要不同程度的面对人“生”的烦恼和对人“死”的恐惧，从这种精神境界上讲，超脱生死便成了人的终极目标，所以才有了对宗教的信仰和研究。对佛教而言，成佛是学佛的真正目的，既然佛性人本具足，为什么人仍处于“人”的状态，而未成佛？为了解释这一点，首先要了解一下对佛性的不同称谓。随着佛教的发展，“佛性”一词有了更多的异名，如：中道、涅槃、法性、真如、实际、法界、如来藏……等等。这些不同的称谓，在不同的语境中所表达的意义并不完全一样，但都和佛性基本相同或相通。“如来藏”与“佛性”相通，佛教用如来藏理论来说明人未成佛之因。

2 结果与分析

2.1 外源激素对不定根诱导的影响

2.1.1不同浓度NAA对不定根诱导的影响 不同浓度NAA对不定根的诱导效果见表1和图1。当以茎段为外植体时，随NAA浓度的增加不定根生根率先增加后降低，当NAA浓度为0.5 mg·L-1时，生根率最高，达94.44%，生根数最多、生长旺盛且不定根粗长；以叶为外植体时，随NAA浓度的增加不定根生根率呈现增长趋势，当NAA浓度为2.0 mg·L-1时，不定根生根率最高，达88.89%，不定根生长旺盛、生根数最多但不定根较细短。从表1可知，生根率、生根外植体数和总根数最高的都是NAA浓度0.5 mg·L-1，并与其他浓度存在显著差异(P<0.05)，说明MS+0.5 mg·L-1NAA是诱导不定根的理想培养基。

表1 NAA浓度和外植体类型对欧洲缬草不定根诱导的影响Table 1 Effects of NAA concentration and explant types on adventitious root induction of V. officinalis

A: 0.5 mg·L-1 NAA下茎段诱导的不定根; B: MS+0.05 mg·L-1 IAA下茎段诱导的不定根; C: MS+0.05 mg·L-1 IBA下茎段诱导的不定根; D: MS+2.0 mg·L-1 NAA下叶片诱导的不定根; E: MS+1.0 mg·L-1 IAA下叶片诱导的不定根; F: MS+0.1 mg·L-1 IBA下叶片诱导的不定根。A: Induced adventitious roots by stem segments under MS+0.5 mg·L-1 NAA; B: Induced adventitious roots by stem segments under MS+0.05 mg·L-1 IAA; C: Induced adventitious roots by stem segments under MS+0.05 mg·L-1 IBA; D: Induced adventitious roots by leaf under MS+2.0 mg·L-1 NAA; E: Induced adventitious roots by leaf under MS+1.0 mg·L-1 IAA; F: Induced adventitious roots by leaf under MS+0.1 mg·L-1 IBA.图1 不同诱导条件下的欧洲缬草不定根Fig.1 Adventitious roots of V. officinalis under different induction conditions

欧洲缬草种子采自延边大学农学院3号温室内的三年生实生苗植株。欧洲缬草种子采下晾干后，置于4 ℃冰箱冷藏待用。

2.1.3不同浓度IBA对不定根诱导的影响 不同浓度IBA对不定根的诱导效果见表3和图1。当以茎段为外植体时，随IBA浓度的增加不定根生根率呈逐渐降低的趋势。当IBA浓度为0.05 mg·L-1时，生根率最高，达83.33%，并且生根数多，生长旺盛、不定根粗长，与其他浓度有显著差异(P<0.05)，说明当茎段为外植体时MS+0.05 mg·L-1IBA是诱导不定根的理想培养基；以叶为外植体时，随IBA浓度的增加不定根生根率先增加后降低，当IAA浓度为0.1 mg·L-1时，不定根生根率最高，达85.19%，同时不定根生根数较多，生长较旺盛、不定根也较粗长。从表3来看，叶片为外植体、IBA浓度为0.1 mg·L-1的生根率要稍优于茎段为外植体、IBA浓度为0.05 mg·L-1，但是前者不定根总数较少，并且两者与其他浓度存在显著差异(P<0.05)。另外，从图1也可以看出，后者的不定根不但总数比前者多而且不定根也比前者粗长。所以，MS+0.05 mg·L-1IBA是诱导不定根的理想培养基。

表2 IAA浓度和外植体类型对欧洲缬草不定根诱导的影响Table 2 Effects of IAA concentration and explant types on adventitious root induction of V. officinalis

表3 IBA浓度和外植体类型对欧洲缬草不定根诱导的影响Table 3 Effects of IBA concentration and explant types on adventitious root induction of V. officinalis

2.1.4不定根诱导理想条件 将图1中C和D、E和F、G和H进行两两比较，可以看出,以茎为外植体诱导的不定根数目多且粗长，明显优于以叶片为外植体。所以，茎段是不定根诱导的理想外植体。虽然在以茎为外植体时，0.5 mg·L-1NAA、0.05 mg·L-1IAA以及0.05 mg·L-1IBA诱导的不定根都生长旺盛、粗长，但是从诱导不定根的数量上看0.5 mg·L-1NAA>0.05 mg·L-1IBA>0.05 mg·L-1IAA，另外，在整体诱导不定根的效果上NAA>IAA>IBA。因此，欧洲缬草不定根诱导的理想外植体为茎，理想培养基为MS+0.5 mg·L-1NAA。

藤尾死亡的结局也给读者带来巨大的震撼，夏目漱石给送去死的世界。虽然有很多读者对藤尾的死唏嘘不已，但藤尾的死是不可避免的。本书的名字是《虞美人草》，虞美人草原本就是在虞姬去世后埋葬的草，象征着虞姬和西楚霸王项羽美丽悲伤的爱情，藤尾和小野无法结出爱情的果实，间接暗示藤尾的死。文中没有明确地描绘虞美人和项羽的故事，但是藤尾和小野交流的作品，死亡是藤尾最终的归宿。

2.2 不定根悬浮培养

2.2.1不同培养基种类对不定根悬浮培养的影响 从表4可以看出，6种培养基中，RCM培养基表现最好，不定根生长旺盛，数目多且较粗长(图2)，其收获鲜重达7.80 g·L-1，收获干重达1.46 g·L-1，并且其干物率也最高，为18.73%，其次是MS培养基，最差的是White培养基(图2)，不定根几乎不生长，不同种类培养基间收获鲜重、收获干重和增殖倍数存在极显著差异(P<0.01)，不同种类培养基间干物率不存在显著差异。虽然接种量有些差异会影响增殖情况，但是从增殖倍数和图2综合来看，RCM培养基是欧洲缬草不定根悬浮培养的理想培养基。

2.2.2不同外源激素对不定根悬浮培养的影响

从表5可以看出，不定根的增殖倍数随着NAA浓度的增加先增加后降低，与之前不定根诱导时表现相同，即在NAA浓度为0.5 mg·L-1时，增殖倍数达到24.51倍，不定根生长旺盛(图3)。不定根增殖倍数随着IAA浓度的增加而降低，在IAA浓度为0.05 mg·L-1时，增殖倍数达到18.02倍，不定根生长较旺盛(图3)，不同激素浓度间缬草不定根的增殖情况有极显著差异(P<0.01)。虽然接种量有些差异会影响增殖情况，但是从不定根生长和增殖倍数(图3)综合来看，0.5 mg·L-1NAA是欧洲缬草不定根悬浮培养的理想外源激素。

表4 培养基种类对不定根悬浮培养的影响Table 4 Effects of medium types on the suspended culture of adventitious roots

表5 外源激素对不定根悬浮培养的影响Table 5 Effect of exogenous hormones on the suspended culture of adventitious roots

图3 不同外源激素下悬浮培养的不定根Fig.3 Adventitious roots of suspended culture by the different exogenous hormones

3 讨论

3.1 不定根诱导理想条件

近年来,研究证实植物次生代谢产物在已分化的器官中比愈伤组织、悬浮细胞中含量高，研究重点也逐渐转移到了已分化的不定根等器官的培养上[9]。通过使外植体在培养过程中分化而产生的不定根，其结构和代谢特征具有合成次生代谢产物能力强、基因型稳定和代谢产物稳定等优点[10-11]，同时韩国高丽参不定根大规模培养[12]、雷公藤不定根中试放大[13]、紫松果菊不定根规模化生产[14]、丹参不定根的中试[15]、甘草不定根反应器培养[16]等研究充分说明药用植物不定根培养是根部活性成分含量较高植物工业化生产的有效途径。

不定根的发生受许多因素的影响，其中生长素类物质和外植体类型对不定根的发生起着关键作用，生长素类似物会影响不定根的细胞分化，发育以及形态的建成，而不同外植体对不定根的诱导能力不同。不同药用植物适宜诱导的外植体不同，适宜诱导不定根的激素种类和浓度不同[17]，Wu等[18]在考察了IAA、IBA、NAA等不同生长素对紫锥菊不定根的诱导情况后，发现IBA是诱导的最佳激素；袁媛等[19]在苍术不定根培养中分别考察了根、叶片、叶柄、子叶4种材料对不定根诱导的影响，发现以叶片为外植体时不定根诱导率最高，根次之；张坚等[20]在对甘草不定根研究中发现，NAA较IBA更有利于不定根的诱导，BA和KT则抑制不定根的诱导；外植体为根时诱导率为100%，而外植体为茎时不能诱导出不定根，形成了愈伤组织。本试验研究了缬草茎和叶片两种外植体在不同浓度IAA、NAA和IBA下不定根诱导情况，结果发现茎段为外植体要优于叶片，NAA要优于IBA、IAA，MS+0.5 mg·L-1NAA是诱导不定根的理想培养基。

3.2 不定根悬浮培养理想条件

不定根的悬浮培养同样受许多因素的影响，其中,培养基种类和外源激素对不定根的增殖发生起着关键性的作用。

不同的基本培养基中含有不同浓度的无机盐、碳源、维生素等物质，可造成培养效果不同。李斌等[21]发现MS为金铁锁不定根生长的较优基本培养基；杨秀莲等[22]研究发现MS培养基更适合海州常山叶片愈伤组织的形成。本试验在研究不同培养基种类对不定根悬浮培养的影响时发现，RCM培养基特别适合欧洲缬草不定根的悬浮培养，增殖倍数达7.64±1.94，生长势好，显著优于其他培养基；在以RCM为基本培养基，研究不同浓度NAA和IAA对欧洲缬草不定根悬浮培养的影响时，发现NAA和IAA对欧洲缬草不定根增殖均起到良好的作用，但NAA对不定根增殖效果优于IAA，并且NAA浓度为0.5 mg·L-1时不定根增殖效果最好，增殖倍数达24.51±3.94，在生物量和生长速度上显著优于崔磊[23]的研究结果(以MS+ 0.2 mg·L-1IBA + 0.2 mg·L-1KT悬浮培养宽叶缬草不定根，接种28 d后生物量为623 mg，生长速率为420%)。本研究所得方法更有利于短期内获得大量不定根。可能是因为RCM培养基中某种离子或者大分子可以促进欧洲缬草不定根细胞伸长和分裂，从而使得不定根长度和数量的显著增加。欧洲缬草不定根有效成分种类和含量的分析测定以及外源激素对欧洲缬草不定根诱导机制等问题，还需进一步的研究。