α-核突触蛋白转基因小鼠肝组织内源性代谢产物的变化规律研究

陈 宁,隋云鹏,苏东宁,魏明豪,孟凡刚*

(1首都医科大学附属北京天坛医院神经外科,北京 100070;2首都医科大学附属北京天坛医院神经内科;*通讯作者,E-mail:fgmeng@ccmu.edu.cn)

α-核突触蛋白(α-synuclein)是一种在中枢神经系统突触前及核周表达的可溶性蛋白质,在正常的生理状态下是一种天然的未折叠的蛋白质,由140个氨基酸组成。帕金森病(Parkinson disease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性不自主运动疾病,其确切的病理机制目前仍未明确[1,2]。近年研究已发现α-核突触蛋白的基因(SNCA)突变会导致罕见的家族型帕金森病的发生,其产生的毒性作用最终会引起多巴胺神经元的凋亡[3,4],提示α-核突触蛋白与PD的发生发展关系密切。但其确切的分子关联机制仍未完全揭示。阐明α-核突触蛋白的病生理机制不仅有助于揭示PD的病理发生发展过程、为寻找干预手段治疗PD提供分子基础,而且对于发现α-核突触蛋白相关的新的病源亦具有重要意义。

系统生物学是近年基于整体和系统的思想理念提出的。作为系统生物学的重要研究策略和手段,代谢组学是从总体的角度分析一个生物系统中某一类型的所有相对分子质量1 000以内的小分子物质。通过内源性代谢产物的变化,从活性、功能、表达等多个层面反向推理机体内发生变化的特定生物分子[5-8]。因此,代谢组学可一次同时系统地挖掘变化的分子或其相关的分子调控网络。本研究借助代谢组的研究工具,通过比较野生型和基因敲除小鼠的体内代谢产物的变化,寻找与这些产物相关的调控通路和生物分子网络,旨在进一步明确α-核突触蛋白的生理功能和病理意义,为临床上诊断和治疗α-核突触蛋白相关性疾病提供新的参考依据和数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器和试剂 DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪,Thermo Q EXACTIVE质谱仪，色谱柱：Thermo Syncronis C18(1.7 μm，2.1 mm×100 mm),Milli-Q AdvantageA10型超纯水仪(美国Millipore公司)，KQ-250超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。甲醇、乙腈(购于国药集团)，甲酸均为色谱级(Themo Fisher),-80 ℃冰箱(Themo公司)离心机(Sigma)、电子天平(METTLER TOLEDO)。醋酸纤维素钠(购于国药集团)。

1.1.2 动物 Alpha-synucleinA53T雄性纯合转基因(TG)小鼠购自南京大学模式动物研究所(动物合格证编号:N000160),首都医科大学实验动物中心按照SPF级别饲养,同时以相应月龄的通窝雄性野生型(WT)小鼠为对照,来自首都医科大学动物部。以上动物均适应性饲养1周后进行正式试验。每次实验前动物先在超净台适应1 h。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药 随机取10只野生型小鼠以及10只转基因小鼠,分别为WT组(A)和TG组(B),均常规喂养,自由饮水。实验动物采用椎脱臼处死法处死。取肝脏组织用生理盐水清洗,滤纸擦干称重,置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 样品采集和处理 采用甲醇 ∶乙腈(1 ∶1)有机溶剂沉淀蛋白法。在肝组织中加入10倍甲醇匀浆 3 min,匀浆液取出100 μl加入甲醇 ∶乙腈(1 ∶1)有机溶剂沉淀蛋白,涡旋30 s,在4 ℃条件下离心15 min(13 000 r/min),取上清液直接进样分析。

1.2.3 液相色谱(UPLC)条件 仪器名称：DIONEX Ultimate 3000超高效液相色谱仪,色谱柱：Thermo Syncronis C18 1.7 μm,2.1 mm×100 mm。液相条件：A为水(含0.1%甲酸及2 mmoL/L甲酸铵)，D为乙腈；梯度洗脱，分析时间0-35 min,进样量10 μl，流速0.3 ml/min。流动相梯度见表1。

表1 液相色谱中梯度条件

Table 1 Gradient conditions for UPLC

时间(min)水(%)乙腈(%)09551.0095516510016.01510018955

1.2.4 质谱(MS/MS2)条件 仪器名称:Thermo Q EXACTIVE,离子源:ESI(-);监测模式:一级全扫描(Full scan),二级数据依赖性扫描(Full MS/dd-MS2);离子源参数:ESI(-),喷雾电压2 800 V;蒸发温度350 ℃;化合物参数:一级全扫描(Full scan),分辨率70 000;二级数据依赖性扫描(Full MS/dd-MS2),分辨率35 000。

1.2.5 质量控制 选择1 ∶1的乙腈/甲醇混合溶液进行蛋白沉淀处理,以确保尽可能多的代谢产物都溶解。取各组混合样品,除杂,离心,取上清200 μl,进样,每5针,平行进一针作为质量控制,以考察仪器的稳定性,重复性及样品的稳定性。

1.2.6 数据处理及分析 数据采用mzcloud对小鼠肝组织内源性代谢物质进行鉴定,利用分子式和分子量确定内源性物质,同时在Trace Finder软件进行自建内源性物质,Metlin,HMDB及KEGG数据库中进行检索和确认。采用Metaboanalyst 4.0进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLSDA)及正交偏最小二乘判别分析(Analysis OPLS-DA)和拓扑分析,使用R统计软件包进行高通量代谢通路分析。最后用Cytoscape及metsape和MCODE插件绘制内源性物质网络图模块化分析。

2 结果

2.1 两组样本UPLC-MS数据模式的偏最小二乘法判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)识别

采用PLS-DA和Orthogonal PLS-DA分析方法将WT组和TG组肝脏组织代谢组学数据进行分析,结果见图1。由图1可知,两组样本之间的样本点相分离,且同一组内各样本点在一定范围内聚集较好,提示两组之间的代谢产物和代谢特征具有明显的差异。

图1 WT组和TG组小鼠肝脏组织样本主成分分析和聚类分析Figure 1 PCA and cluster analysis of liver tissue samples from wild type group and transgenic group

2.2 肝脏组织样品中的差异代谢物

采用PLS-DA和Orthogonal PLS-DA分析方法得到一个20样本×461变量的数据矩阵。在PLS-DA模型中提取VIP值最大的前74个变量(VIP值>1.0)。这74个变量的载荷矩阵图距原点比较大的距离。对这74个变量进行手动积分及非参数检验,通过对目标变量进行手动积分,并综合VIP值、非参数检验和ROC曲线的精密度(>0.5)来筛选差异代谢物,确定了27个变量为代谢标志物,结果见表2。

2.3 肝脏组织中差异代谢物的代谢通路分析

将选择代谢通路影响值的临界设置为0.10,高于这个值,认为与潜在的靶标路径关系密切。结果显示,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、花生四烯酸代谢、组氨酸代谢、肌醇磷酸代谢通路影响值大于0.10,提示PLS-DA所筛选出的差异代谢物与这几个代谢途径存在有密切的相关性,进一步说明α-核突触蛋白变异后引起的小鼠病理生理变化与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，甲烷代谢，酪氨酸代谢，组氨酸代谢甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢，苯丙氨酸代谢，甘油磷脂代谢，氨酰基-tRNA生物合成等代谢途径有密切的关系(见表3，图2)。

表2 α-核突触蛋白转基因小鼠肝组织潜在生物标志物的相对含量

Table 2 Relative content of potential biomarkers in liver tissue in transgenic mice

代谢产物 野生型转基因型 差异倍数P VIP多巴胺1.01±0.6416.39±5.97∗∗16.24↑0.00000022.6816次黄嘌呤4.02±0.538.17±0.42∗∗2.03↑0.0001352081.2829L-丙氨酸1.94±0.181.59±0.17∗0.82↓0.0329025622.9765L-组氨酸1.97±0.201.64±0.11∗0.84↓0.0320794072.8635L-丝氨酸3.86±0.143.28±0.13∗0.85↓0.0261414511.2285L-苏氨酸6.24±0.165.12±0.19∗0.82↓0.0395604211.6521L-酪氨酸1.59±0.161.25±0.19∗0.79↓0.0159886783.0632苯乙胺0.78±0.191.49±0.74∗∗1.91↑0.007074961.4746别嘌呤醇5.70±0.194.41±0.22∗0.77↓0.0269610615.79261,2,3-丙三羧酸1.55±1.3713.19±6.82∗∗8.53↑0.0030368211.9662-脱氧葡萄糖5.70±0.194.41±0.22∗0.77↓0.0269610615.7926肌酸2.38±0.411.61±0.17∗0.68↓0.034301294.3791吡啶甲酸5.60±0.4910.29±0.91∗1.84↑0.0196400981.1314软脂酸1.53±0.281.09±0.18∗0.72↓0.0136820221.1151抗坏血酸1.55±1.3713.19±6.82∗∗8.53↑0.0030368211.9663-甲基-2-氧代丁酸酯0.99±0.371.60±0.29∗∗1.62↑0.0006016691.4994N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯2.50±0.637.82±1.81∗∗3.13↑0.0024998261.3394十六烷酸1.53±0.281.09±0.18∗0.72↓0.0136820221.1151溶血性磷脂酰乙醇胺(0:0/18:1(9Z))2.90±0.371.92±0.19∗0.66↓0.0192773071.6436溶血性磷脂酰乙醇胺(0:0/18:2(9Z,12Z))2.36±0.351.35±0.22∗∗0.57↓0.0043127131.8071溶血性磷脂酰乙醇胺(0:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))6.02±0.274.05±0.15∗∗0.67↓0.0033156672.5509溶血性磷脂酰乙醇胺(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0)6.02±0.274.05±0.15∗∗0.67↓0.0033156672.5509磷脂酰胆碱(14:0/22:0)15.88±1.170.35±0.01∗0.02↓0.0164790682.0841磷脂酰胆碱(18:1(11Z)/20:0)10.52±0.652.63±0.16∗∗0.25↓0.002282261.6365磷脂酰胆碱(18:1(9Z)/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))21.39±0.3014.75±0.32∗0.69↓0.0380525441.2798磷脂酰甘油(18:0/18:0)8.37±1.111.84±0.24∗0.22↓0.0440031261.2525胆酸14.21±0.864.57±0.20∗0.32↓0.0264290791.5881

与WT组相比,*P<0.05,**P<0.01;比率=TG组/WT组,“↑”示较WT组上调倍数,“↓”示较WT组下调倍数;“()”中所示为该代谢产物的碳链的碳数、双键数目及其相应位置,不同碳链通过“/”分隔

表3 构建的分析通路(Impact>0.10)

Table 3 Constructed analytical pathway(Impact>0.10)

代谢通路代谢物总数相关代谢物个数 相关代谢物影响值苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成41酪氨酸0.5甲烷代谢91丝氨酸0.4酪氨酸代谢442酪氨酸、多巴胺0.3组氨酸代谢151组氨酸0.2甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢313苏氨酸、丝氨酸、肌酸0.2苯丙氨酸代谢112酪氨酸、苯乙胺0.2甘油磷脂代谢301磷脂酰胆碱0.1氨酰基-tRNA生物合成695酪氨酸、苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸、组氨酸0.1

图2 使用MetPA数据库构建重要内源性小分子相关代谢通路Figure 2 Construction of important endogenous small molecule-related metabolic pathways using the MetPA database

3 讨论

α-核突触蛋白(α-synuclein)是一种在中枢神经系统突触前及核周表达、正常生理状态下呈天然的未折叠的可溶性蛋白[9]。有研究显示,α-核突触蛋白的基因突变会导致罕见的家族型帕金森病(Parkinson disease,PD)的发生,其产生的毒性作用最终会引起多巴胺神经元的凋亡[10-12],进而引起帕金森的发生。但鉴于机体内生物分子网络之间关系的复杂性,α-核突触蛋白的变异会影响体内多个生物靶点以及这些靶点关联的组织器官的功能。明确α-核突触蛋白相关靶点所构成的生物分子网络有助于全面解析其在机体内的生物功能,从而为利用该分子靶点构建机制明确的病理模型或开发针对该靶点的有效治疗药物。代谢组学是近年发展起来的对机体内源性小分子物质的整体及其动态变化规律的检测分析的一门新技术,其研究的是特定的生物体系受到干预后产生的内源性代谢变化,可以对那些能描述代谢循环情况的关键化合物进行定性和定量分析,进而明确该生物复杂系统中所有组成成分的构成及在特定条件下这些组分之间的相互关系[7,8]。目前最常用的分离分析手段包括气相色谱、液相联用质谱及核磁共振技术以及质谱联用液相色谱。

本研究利用液质联用技术,以肝脏组织为研究对象,对α-核突触蛋白转基因模式动物小鼠的内源性代谢产物进行了检测,采用主成分、聚类分析等化学计量学方法进行了深入挖掘。研究发现,α-核突触蛋白变异后,苯丙氨酸、络氨酸和色氨酸生物合成,苯丙氨酸代谢,甲氨酸代谢,络氨酸代谢,组氨酸代谢,甘油磷脂代谢,氨酰tRNA生物合成等代谢通路受到了显著影响,其中涉及络氨酸、丝氨酸、肌酸、多巴胺、组氨酸、苯乙胺、磷脂酰胆碱、苏氨酸、丙氨酸等标志性代谢产物的生物学变化。其中,多巴胺和苯乙胺表达上调。多巴胺是遍布整个大脑的信号分子,在调节情绪和控制运动方面起到重要作用,与帕金森氏症、抑郁症和精神分裂症等有关。同时多巴胺也是合成去甲肾上腺素及肾上腺素的前体物,主要表现为外周作用,具有兴奋肾上腺素α、β受体的作用,但对β2受体作用较弱;同时也作用于肾脏和肠系膜血管、冠状动脉的多巴胺受体,但其末梢作用较复杂。肝脏作为腹腔内不成对脏器静脉血的“收集器”,其多巴胺水平的高低能够反映机体外周血液中的含量。目前医学界认为帕金森症是由于多巴胺能神经元受损,多巴胺分泌不足,不能持续地分泌多巴胺,从而出现了运动障碍所致[13-15]。而本研究发现α-核突触蛋白变异后小鼠肝组织中多巴胺水平增高,其可能的机制与α-核突触蛋白变异后中枢多巴胺合成或分泌不足导致的外周多巴胺的代偿性合成增多有关。值得关注的是,多巴胺水平增高会进一步提高肾上腺素的合成,进而引起心血管等的生物学功能变化。本研究中苯丙氨酸和苯乙胺同时增高,与苯乙胺(phenethylamine,PEA)是苯丙氨酸在脑中通过脱羧作用而生成的研究报道相吻合。苯乙胺能诱导儿茶酚胺受体生成,是一种单胺类神经递质或神经调解剂,具有提升细胞外液中多巴胺水平的作用[16,17],肝脏组织中多巴胺含量的升高可能与苯乙胺的上调具有一定的因果关系。本研究首次明确了小鼠α-核突触蛋白变异对于肝脏代谢的影响,因为帕金森病为全身性疾病,所以对于进一步明确帕金森病的病理机制具有一定的意义。